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Apr 02, 2023

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Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2836 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eines der Schlüsselereignisse bei viraler Enzephalitis ist die Fähigkeit des Virus, in das Zentralnervensystem (ZNS) einzudringen. Mehrere enzephalitische Viren, darunter das La-Crosse-Virus (LACV), lösen vor allem bei Kindern, nicht jedoch bei Erwachsenen, eine Enzephalitis aus. Dieses Phänomen wird auch in LACV-Mausmodellen beobachtet, bei denen das Virus durch vaskuläres Austreten von Gehirnmikrogefäßen, wahrscheinlich durch Gehirnkapillarendothelzellen (BCECs), Zugang zum ZNS entwöhnter Tiere erhält. Um alters- und regionalspezifische regulatorische Faktoren der Gefäßleckage zu untersuchen, verwendeten wir genomweite Transkriptomik und gezieltes siRNA-Screening, um Gene zu identifizieren, deren Unterdrückung die virale Pathogenese in BCECs beeinflusste. Eine weitere Analyse zweier dieser Genprodukte, Connexin43 (Cx43/Gja1) und EphrinA2 (Efna2), zeigte einen erheblichen Einfluss auf die LACV-Pathogenese. Die Induktion von Cx43 durch 4-Phenylbuttersäure (4-PBA) hemmte neurologische Erkrankungen bei entwöhnten Mäusen, während ein Efna2-Mangel die Erkrankung bei erwachsenen Mäusen verstärkte. Somit zeigen wir, dass Efna2 und Cx43, die von BCECs exprimiert werden, Schlüsselmediatoren der LACV-induzierten Neuroinvasion und neurologischen Erkrankungen sind.

Das La-Crosse-Virus (LACV), ein Negativ-RNA-Virus aus der Familie der Bunyaviridae1, ist eine der Hauptursachen für arbovirale Enzephalitis bei Kindern2. Bei Erwachsenen verursacht eine LACV-Infektion im Allgemeinen ein sehr mildes, fieberhaftes Syndrom3. Die höhere Inzidenz neurologischer Erkrankungen bei Kindern im Vergleich zu Erwachsenen deutet auf altersbedingte Unterschiede hin, die möglicherweise für die Fähigkeit des Virus verantwortlich sind, Zugang zum Zentralnervensystem (ZNS) zu erhalten und/oder Schäden im ZNS zu verursachen. Das Verständnis dieser Unterschiede könnte Möglichkeiten zur Prävention oder Behandlung von LACV-Enzephalitis eröffnen.

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine selektiv durchlässige Barriere, die eine wichtige Rolle bei der Hemmung des Zugangs von Krankheitserregern zum ZNS spielt. Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​besteht hauptsächlich aus Gehirnkapillarendothelzellen (BCECs) mit benachbarten Astrozyten, Basalmembranen und Perizyten, die mit umgebenden Neuronen und Mikroglia interagieren, um die neurovaskuläre Einheit zu bilden4. Die selektive Permeabilität über die BCECs hinweg wird durch mehrere Transporter- und Trägerproteine ​​sowie die Proteine ​​Tight Junction (TJ), Adherens Junction (AJ) und Gap Junction (GJ) (zusammen Cell Junction (CJ)) definiert5,6. Die Integrität der BBB wird während der Entwicklung gestärkt7,8. Sie erreicht ihren Höhepunkt im Erwachsenenalter und schwächt sich dann mit zunehmendem Alter aufgrund der verminderten CJ-Proteinexpression und der Funktionsbeeinträchtigung der Transporter allmählich ab9,10.

Die bei der LACV-Enzephalitis beobachtete Pathologie weist auf einen erheblichen Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke hin. Die immunhistochemische (IHC) Analyse von Gehirnbiopsien von LACV-Patienten zeigt perivaskuläre mononukleäre Manschetten mit fokalen Aggregaten von Immunzellen11, und weitere Studien haben eine durch LACV-Enzephalitis verursachte Gefäßschädigung gezeigt12. Daher ist die LACV-Enzephalitis eng mit neurovaskulären Pathologien und Anomalien verbunden.

Eine ähnlich altersabhängige LACV-Enzephalitis und Gefäßpathologie wird im C57BL/6-Mausmodell beobachtet. Entwöhnte Mäuse (ca. 3 Wochen alt) sind sehr anfällig für eine LACV-Infektion des ZNS und entwickeln klinische Erkrankungen nach entweder peripherer (intraperitonealer, IP) oder direkter ZNS-Infektion (intrazerebral, IC). Im Gegensatz dazu sind erwachsene Mäuse im Alter von ≥6 Wochen resistent gegen periphere Infektionen (IP), aber anfällig für direkte ZNS-Infektionen (IC)13,14,15. Somit gibt es einen deutlichen altersbedingten Unterschied in der Fähigkeit von LACV, nach einer peripheren Infektion Zugang zum ZNS zu erhalten.

Studien zur altersbedingten Anfälligkeit zeigen eine erhöhte Gefäßleckage und einen Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke bei jungen Mäusen nach einer LACV-Infektion. Obwohl LACV-infizierte BCECs in vivo nicht leicht zu beobachten sind, wird der Abbau der BHS durch Leckage spezifisch durch die Mikrogefäße/BCECs in der Region des Riechkolbens (OB)/anterioren Riechkerns (AON) vermittelt, nicht jedoch durch jene im Kortex (CT). ) Region16. Der Virusaustritt erreicht im Allgemeinen 3 Tage nach der Infektion (dpi) seinen Höhepunkt und eine Virusinfektion von Neuronen wird in Regionen beobachtet, die mit diesem Gefäßaustritt verbunden sind. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass eine altersspezifische Reaktion von Mikrogefäßen/BCECs im Gehirn unterschiedliche zytopathische Wirkungen und eine LACV-Anfälligkeit verursacht. Darüber hinaus haben wir mithilfe von ex vivo isolierten Gehirn-Mikrogefäßfragmenten und In-vitro-Kulturen primärer BCECs, die aus entwöhnten und erwachsenen Mäusen isoliert wurden, gezeigt, dass entwöhnte BCECs anfälliger für LACV-Infektionen, die Bildung synzytienartiger Aggregate und den Zelltod von Zuschauern sind17. BCEC-Reaktionen können durch verschiedene Faktoren kontrolliert werden, darunter die Immunantwort des Wirts, das Überleben der Zellen, die Expression funktioneller CJ-Proteine, die Aufrechterhaltung von Blutgefäßen oder durch multigene Interaktionen. Die Identifizierung von Faktoren, die sich während einer LACV-Infektion zwischen entwöhnten und erwachsenen Gehirnmikrogefäßen/BCECs unterscheiden, könnte Einblicke in die Faktoren liefern, die für die Verhinderung einer LACV-Neuroinvasion entscheidend sind.

Wir stellten die Hypothese auf, dass mutmaßliche Restriktionsfaktoren bei den LACV-resistenten erwachsenen Mäusen vorhanden oder verstärkt sein könnten, während mutmaßliche Anfälligkeitsfaktoren bei den LACV-anfälligen entwöhnten Mäusen vorherrschen könnten. Um solche Faktoren zu identifizieren, verwendeten wir zunächst eine auf RNA-Sequenzierung (RNA-seq) basierende Transkriptomanalyse in ex vivo isolierten Mikrogefäßfragmenten des Gehirns, die von entwöhnten und erwachsenen Mäusen erhalten wurden, und bewerteten die Reaktionen auf Polyinosinsäure: Polycytidylsäure (Poly I:C), um virusinduziert nachzuahmen Immunstimulation. Wir verglichen außerdem RNA-seq-Profile in Mikrogefäßfragmenten des Gehirns, die aus der OB- und CT-Region von LACV-infizierten oder scheininokulierten Absetzmäusen isoliert wurden. Kandidatengene, die aus diesen Analysen unterschiedliche Expressionsprofile zeigten, wurden einem gezielten Small Interfering RNA (siRNA)-Screening unterzogen, um mutmaßliche Regulatoren der altersabhängigen LACV-Anfälligkeit zu identifizieren. Hit-Gene wurden auf ihre mögliche Beteiligung am LACV-Infektionsweg untersucht und zwei Gene, Gap Junction Protein Alpha 1 (Gja1) und EphrinA2 (Efna2), wurden als potenzielle therapeutische Ziele zur Kontrolle von LACV-induzierter Gefäßleckage und -entstehung identifiziert Neuroinfektion.

Wir haben zunächst versucht, potenzielle Genregulatoren zu identifizieren, die zur altersabhängigen Anfälligkeit für LACV beitragen. Entwöhnte (W) und erwachsene (A) Mäuse wurden 3 Stunden lang entweder mit Poly I:C (PI) (als Ersatz für einen viralen RNA-Stimulus) oder mit Vehikelkontrolle (V) behandelt. Aus diesen Mäusen isolierte Mikrogefäßfragmente des gesamten Gehirns wurden einer RNA-Seq-Analyse unterzogen, um sowohl intrinsisch altersabhängige als auch durch Poly I: C-Stimulation induzierte Gene zu identifizieren (Abb. 1a). Die Genexpression wurde im Hinblick auf altersbedingte Unterschiede auf Grundniveau verglichen, wobei die Gruppen der entwöhnenden Vehikel (WV) mit denen der erwachsenen Vehikel (AV) verglichen wurden. Aktivierungsvergleiche wurden durchgeführt, indem Weanling Poly I:C stimuliert (WPI) mit WV, Adult Poly I:C stimuliert (API) mit AV sowie WPI mit API verglichen wurden. Vulkandiagramme der differentiellen Genexpression und Pathway-Anreicherungsanalysen (Ingenuity Pathway Analysis, IPA) aus den obigen Vergleichen heben die zellulären Prozesse hervor, die die verschiedenen Behandlungs- und Altersgruppen unterscheiden (ergänzende Abbildung 1a – d). Spezifische Gene für die weitere Bewertung wurden basierend auf der unterschiedlichen Expression zwischen Gruppen mit einem log2-Unterschied von ≥ 1, p <0, 05 und einem Basismittelwert von ≥ 100 ausgewählt (Ergänzungstabelle 1, Gruppe 1). Um die wahrscheinliche Zellzusammensetzung in den isolierten Mikrogefäßfragmenten zu bewerten, haben wir die Expression zelltypspezifischer Gene anhand der RNA-Seq-Daten bewertet (Ergänzungstabelle 2). Dies zeigte, dass BCEC-spezifische Gene stark angereichert waren, es eine mäßige/geringe Expression von Perizytenmarkern gab, aber eine sehr geringe Expression von Genen, die für Astrozyten, Neuronen und glatte Muskelzellen charakteristisch sind. Dies bestätigte, dass die zur Herstellung von Mikrogefäßfragmenten verwendete Methode zu einer hochspezifischen BCEC-Anreicherung führte, wie zuvor beschrieben18,19,20.

ein sequenzieller Ansatz zur Auswahl von Zielgenen aus RNA-Seq-Analysen an mit Vehikel (V) oder Poly I:C (PI) behandelten entwöhnten (W) oder erwachsenen (A) Mäusen (WV, WPI, AV und API). b Identifizierung von Zielgenen aus RNA-seq-Analysen von Mikrogefäßfragmenten aus Riechkolben- (OB) und Kortexregionen (CT) entwöhnter LACV-infizierter (LOB und LCT) und scheingeimpfter Mäuse (MOB und MCT) (N = 3 für alle RNA). -seq-Beispiele). Es wurde die standardmäßige DESeq-Funktion mit betaPrior = FALSE angewendet, wobei ein negatives binomiales verallgemeinertes Modell mit Wald-Signifikanztest durchgeführt wurde. Die zweiseitigen p-Werte wurden für Mehrfachtests mit der Benjamini-Hochberg-Methode korrigiert. c–e Differenzielle Expression repräsentativer Gene, validiert durch Echtzeit-PCR-Analysen an ex vivo isolierten Mikrogefäßfragmenten von entwöhnten Scheinmäusen (WM), entwöhnten LACV-Mäusen (WL), erwachsenen Scheinmäusen (AM) und erwachsenen LACV-infizierten Mäusen (AL). Genkategorien: (c) intrinsisch erwachsenenspezifisch (für Efna2 und H2q6 WM vs. AM P = 0,0032 und P = 0,0001 und WL vs. AL P = 0,0002 und P = 0,0356), d intrinsisch entwöhnungsspezifisch (für Bst1 und Mmp25 WM vs AM P < 0,0001 und P = 0,1010 und WL vs. AL P < 0,0001 und P = 0,4684) oder (e) durch LACV-Infektion induzierte, adulte verstärkte Gene (für Clec4e und Cldn1 WM vs. AM P = 0,0453 und P = 0,0894 und WL vs AL 0,6490 und P = 0,5686). f Differenzielle Expression repräsentativer Gene aus OB- und CT-Mikrogefäßfragmenten, die von LACV-infizierten Erwachsenen (AOB und ACT) und Absetzern (WOB und WCT) erhalten wurden. P = 0,0043 und P = 0,0068 für Aqp1 und Ttr für den Vergleich von WOB und WCT und P = 0,0417 und P < < 0,0001 für Aqp1 und Ttr für den Vergleich von AOB und ACT. Die Daten in (c–f) wurden für eine normalere Verteilung auf die log2-Skala transformiert und die Datenpunkte wurden nach der Transformation statistisch analysiert oder grafisch dargestellt. Die Signifikanzwerte wurden durch eine einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleich (c–e) oder zweiseitigen, mehrfachen ungepaarten t-Tests (f) gemessen (N = 5–6 für alle Mausexperimente, aus Panel c–f und einzeln). Datenpunkte werden angezeigt). (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001).

Da nach einer LACV-Infektion regionale Unterschiede in der BHS-Integrität beobachtet werden und eine Virusinfektion erstmals in der OB-Region bei entwöhnten Mäusen beobachtet wird16, haben wir auch eine RNA-seq-Analyse an Mikrogefäßfragmenten durchgeführt, die aus verschiedenen Regionen von LACV-infizierten (L) und Schein-Mäusen isoliert wurden. Inokulierte (M) entwöhnte Mäusegehirne bei 3 dpi. Gene aus diesem Vergleich wurden auf der Grundlage von zwei unterschiedlichen Genexpressionskriterien ausgewählt: entweder ein Unterschied in der Expression zwischen Mikrogefäßfragmenten aus dem OB von LACV-infizierten Mäusen (LOB) und dem OB von scheininfizierten Mäusen (MOB) oder ein Unterschied im Gen Expression zwischen LOB und Mikrogefäßfragmenten aus der CT von LACV-infizierten Mäusen (LCT) (Abb. 1b). Diese Kriterien wurden verwendet, um zusätzliche Gene für die weitere Analyse auszuwählen (Ergänzungstabelle 1, Gruppe 2). Differenzielle Genexpressions- und IPA-Analysen aus diesen Vergleichen verdeutlichen die erwartete Anreicherung von Interferon und Neuroinflammation nach einer LACV-Infektion des OB sowie Unterschiede in der Gap Junction- und Ephrin-Signalübertragung im OB/CT-Vergleich (ergänzende Abbildung 1e, f). Schließlich haben wir zusätzlich zu den ausgewählten Genen der Gruppen 1 und 2 auch Gene einbezogen, von denen bekannt ist, dass sie die BBB-Funktion und die Immunantwort des Wirts auf LACV beeinflussen, die jedoch in der obigen RNA-Sequenzanalyse nicht unbedingt differenziert wurden (Ergänzungstabelle 1, Gruppen 3 und 4, jeweils).

Um die Expressionsunterschiede der ausgewählten Gene weiter zu bestätigen, analysierten wir die Expression mittels qPCR nach einer LACV-Infektion. RNAs wurden aus Mikrogefäßfragmenten extrahiert, die von LACV-infizierten erwachsenen (AL) oder entwöhnten (WL) Mäusen mit 3 dpi sowie von scheininokulierten entwöhnten (WM) und erwachsenen (AM) Mäusen erhalten wurden, während zusätzliche Mikrogefäßfragmente aus OB und extrahiert wurden CT-Regionen von LACV-infizierten (3 dpi) entwöhnten und erwachsenen Mäusen. Echtzeit-PCR-Analysen an ex vivo isolierten Mikrogefäßfragmenten zeigten, dass Gene in vier Hauptkategorien fallen: durch Erwachsene verstärkt, durch Entwöhnung verstärkt, durch LACV induziert und regional spezifisch (OB-CT) (Abb. 1c – f). Beispielsweise wurden EphrinA2 (Efna2; ein angiogenes Molekül) und H2q6 (zur MHC-Klasse-I-Familie gehörend) in adulten Mikrogefäßfragmenten unabhängig von einer Virusinfektion in höheren Konzentrationen exprimiert (Abb. 1c). Das Knochenmark-Stromazell-Antigen 1 (Bst1; ein Immunregulator) und die Matrix-Metallopeptidase 25 (Mmp25) wiesen bei entwöhnten Mäusen höhere Grundwerte auf (Abb. 1d). Die C-Typ-Lektindomänenfamilie 4, Mitglied e (Clec4e; ein Molekül, das LACV erkennt und eine begrenzte Rolle bei frühen antiviralen Reaktionen gegen LACV21 spielt) und Claudin 1 (Cldn1; ein TJ-Protein, das in Endothel-/Epithelzellen vorhanden ist) wurden durch LACV erhöht Infektion bei erwachsenen Mäusen, jedoch nicht bei entwöhnten Mäusen (Abb. 1e). Nur wenige Gene wurden zwischen OB- und CT-Mikrogefäßfragmenten unterschiedlich exprimiert. Unter diesen waren zwei Gene zur Aufrechterhaltung der Homöostase, Aquaporin 1 (Aqp1; ein passiver Transporter) und Transthyretin (Ttr; ein Trägerprotein), in CT-Mikrogefäßfragmenten sowohl von entwöhnten (WCT) als auch erwachsenen (ACT) Mäusen im Vergleich zu OB-Mikrogefäßfragmenten, die aus erhalten wurden, erhöht entwöhnte (WOB) und erwachsene (AOB) Mäuse. Der paarweise Vergleich zwischen den OB- und CT-Mikrogefäßfragmenten wird für jede Altersgruppe gezeigt (Abb. 1f). Daher identifizierten wir Gene durch RNA-Seq- (Abb. 1a, b) und qPCR-Analysen (Abb. 1c – f), die in Mikrogefäßfragmenten je nach Alter, Infektion oder Region unterschiedlich exprimiert wurden, für weitere Untersuchungen.

Um direkt zu untersuchen, ob die ausgewählten Gene die virale Pathogenese beeinflussen können, verwendeten wir ein In-vitro-Modell der Endothelzell-LACV-Infektion. Wir haben zuvor herausgefunden, dass infizierte Endothelzellen zwar in vivo nicht leicht nachweisbar sind, in vitro jedoch altersabhängig infiziert werden und diese Infektion mit einer direkten und unbeteiligten Schädigung der Endothelzellen verbunden ist17. Um einen auf Genstörungszellen basierenden Screening-Assay zu etablieren, wählten wir eine Maus-Endotheliom-Zelllinie, bEnd.3, da diese Zellen mit LACV infiziert werden konnten und leicht für die siRNA-Transfektion zugänglich waren. Um die siRNA-Abgabe zu optimieren, verwendeten wir letale und nicht zielgerichtete (NT) Kontroll-siRNAs, um verschiedene Transfektionsreagenzien zu testen und Bedingungen mit maximaler Zelltötung mit letaler siRNA zu identifizieren, während mit der si-NT-Kontrolle maximale Lebensfähigkeit aufrechterhalten wurde. Dadurch wurde ein optimales Abgabeprotokoll unter Verwendung von 50 nM siRNA mit dem Transit-TKO-Transfektionsreagenz ermittelt (ergänzende Abbildung 2a). Anschließend haben wir drei Kontrollbedingungen für das Screening festgelegt: a) eine Grundbedingung für eine LACV-Infektion mit NT-siRNAs, b) eine Kontrolle für bekannte Restriktionsfaktoren unter Verwendung einer Kombination von siRNA zu Ifnar1 und Ifnar2 (si-Ifnar oder si-Upreg. Kontrolle); hochregulierte LACV-Infektion) und c) eine Kontrolle für bekannte Anfälligkeitsfaktoren unter Verwendung einer Kombination von siRNAs zur schweren Kette von Clathrin und Rab5a (si-CltcRab oder si-Downreg. Kontrolle; herunterregulierte LACV-Infektion) (Ergänzende Abb. 2b, c).

Anschließend haben wir die 35 ausgewählten Gene gescreent, die in der Ergänzungstabelle aufgeführt sind. 1 zusammen mit den drei Kontrollbedingungen in drei verschiedenen Phasen der LACV-Infektion auf BCEC-Monoschichten bei Raumtemperatur. Die erste war die frühe Phase (6 hpi; Abb. 2a), was auf eine Auswirkung auf den Viruseintritt schließen lässt. Die zweite war die mediale Infektionsphase (24 hpi; Abb. 2b), was auf eine Auswirkung auf die Virusreplikation und -ausbreitung durch die Endothelzellkultur hindeutet. Diese kinetischen Phasen wurden in ähnlicher Weise bei einer LACV-Infektion in einer anderen Zelllinie beobachtet22. Der zellbasierte Assay für diese ersten beiden Phasen verwendete einen Anti-LACV-Antikörper, um die Intensität der viralen Fluoreszenz pro Zelle zu messen. Dies wurde durch Messung der LACV-Summenintensität (die sowohl von der Anzahl der infizierten Zellen als auch von der Intensität der Infektion beeinflusst wird) und anschließende Quantifizierung des Verhältnisses zur Hoechst-Fläche (wodurch der Intensitätswert auf die Gesamtzellzahl normalisiert wird) bestimmt. Der letzte Spätphasentest (72 hpi; Abb. 2c) maß den Zellverlust durch LACV-induzierten Zelltod. Anhand dieser Kriterien wäre zu erwarten, dass die Beseitigung mutmaßlicher Restriktionsfaktoren zu einer erhöhten LACV-Intensität und einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen führen würde, während die Beseitigung mutmaßlicher Anfälligkeitsfaktoren zu einer verringerten LACV-Intensität und einer höheren Lebensfähigkeit der Zellen führen würde. Wir identifizierten zwei Cluster von Genen, die mutmaßliche Resistenz- oder Anfälligkeitsphänotypen aufwiesen (Farbe hervorgehoben in Abb. 2a – c), wobei repräsentative Bilder der Hoch- oder Herunterregulierung des Virus in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt sind.

bEnd.3-Zellen wurden mit 50 nM siRNA gegen die angegebenen Zielgene (für 72 Stunden) transfiziert, zusammen mit viraler Hochregulierungskontrolle (d. h. si-Ifnar1 und Ifnar2, abgekürzt als si-Upreg. Control), Herunterregulierungskontrolle (d. h. si -Cltc und Rab5a, abgekürzt als si-Downreg. Control), nicht zielgerichtete (si-NT, gepunktete Linie) und Zelltod- (si-Lethal) Kontrollen, sofern angegeben. a, b Analysen des Infektionsgrades (10 MOI von LACV), normalisiert auf si-NT (Verhältnis von LACV-Summenintensität zu Hoechst-Fläche) bei 6 (a) und 24 hpi (b). c Analysen des Zellüberlebens (Kernzahl) bei 72 hpi. Der erste Balken stellt den Durchschnitt von 2 unabhängigen genspezifischen siRNA dar, während die nächsten beiden Balken siRNA Nr. 1 und Nr. 2 für jedes Gen darstellen (Mittelwert ± SD, N = 3 für jede einzelne siRNA). Mutmaßliche Hit-Gene werden in den verschiedenen Diagrammen farblich angepasst.

Zu den mutmaßlichen Restriktionsfaktoren, die im primären Screening identifiziert wurden, gehörten Efna2, Clec4e, Gja1 (ausgedrückt als Connexin43-Protein, abgekürzt als Cx43), Interferon-induziertes Transmembranprotein 3 (Ifitm3, ein RNA-Virusrestriktionsfaktor), Lymphozyten-Antigen-6-Komplex-Locus C2 (Ly6c2) und H2q6. Für H2q6 gab es eine Variation im Phänotyp zwischen 6 und 24 Stunden, wobei eine erhöhte Virusintensität nur zum frühen Zeitpunkt beobachtet wurde (Abb. 2a, b). In H2q6-Knockdown-Kulturen wurden Cluster synzytienartiger Aggregation und mehrkerniger Zellen beobachtet, was die Beschränkung des Phänotyps mit erhöhter Virusintensität auf den frühen Zeitpunkt erklären könnte (weiße Pfeile, ergänzende Abbildung 3a, b). Der Abbau von Gja1 führte zu einer Dissoziation der zellulären Monoschicht (weißer Pfeil, ergänzende Abbildung 3b), was mit seiner etablierten Rolle bei der Gap-Junction-Integrität übereinstimmt. Zu den mutmaßlichen Anfälligkeitsfaktoren gehörten der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor A (Vegfa), das Aktin-Zytoskelett-Remodellierungsprotein Gelsolin (Gsn), Claudin 2 (Cldn2), Claudin 5 (Cldn5) und Tight Junction Protein 2 (Tjp2/ZO2) (Abb. 2a – c). ). Somit wurden mehrere Gene identifiziert, die die LACV-In-vitro-Infektion von bEnd.3-Endothelzellen entweder verstärkten oder reduzierten.

Basierend auf dem gezielten siRNA-Screening wählten wir sieben mutmaßliche Restriktionsfaktoren (Gene der Gruppe 1: Bst1, Efna2, H2q6, Clec4e, Gja1, Ifitm3 und Ly6c2) zur weiteren Validierung in primären BCECs für Erwachsene und Entwöhner aus. Interessanterweise erhöhte der Abbau aller dieser Gene die Anfälligkeit erwachsener primärer BCECs für eine LACV-Infektion (Abb. 3a), während nur der Abbau von Ifitm3 ein signifikant erhöhtes Infektionsniveau bei primär entwöhnten BCECs zeigte (Abb. 3b), was die Annahme stützt, dass diese Gene dies können tragen zur erhöhten LACV-Resistenz bei erwachsenen BCECs bei.

a, b Primäre BCECs von Erwachsenen (a) und Absetzern (b) wurden 72 Stunden lang mit 50 nM siRNA gegen die angegebenen Hit-Gene der Gruppe 1 (hauptsächlich Restriktionsfaktoren) und die LACV-Infektion (Verhältnis von LACV-Summenintensität zu Hoechst-Fläche) transfiziert bewertet (N = 6 und einzelne Datenpunkte werden angezeigt) Hier P = 0,0162, 0,0085, 0,0153, 0,0830, 0,0394, 0,0636, 0,0231 und 0,0271 in (a) und P = 0,6571, 0,9010, 0,0960, 0,1548, 0,9290, 0,0354, 0,0649 und <0,0001 in (b) für si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3, si-Ly6c2 und si-Upreg. Kontrolle vs. si-NT. c LACV-Anheftungs-/Eintrittsassay in bEnd.3-Zellen, die 72 Stunden lang mit 50 nM der angegebenen genspezifischen und Kontroll-siRNAs transfiziert und 24 Stunden lang mit 10 MOI LACV infiziert wurden. d Repräsentative Bilder der LACV-Anlagerung/-Eintritt in Ifitm3- und Lyc2-siRNA-gestörten bEnd.3-Zellen (grün: LACV und blau: Hoechst) (N = 3 für c, d). Hier gilt P = 0,0682, 0,0752, 0,9479, 0,3786, 0,3018, 0,0009, 0,0020 und 0,9574 in (c, links) und P = 0,0980, 0,9622, 0,6042, 0,4154, 0,9939, 0,013 2, 0,0011 und 0,0294 in (c, rechts) für si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3, si-Ly6c2 und si-Upreg. Kontrolle vs. si-NT. e Plaque-Assays (jeder Punkt = 1 Probe), durchgeführt bei 24 hpi in LACV-infizierten bEnd.3-Zellen, die 72 Stunden lang mit 50 nM der angegebenen genspezifischen siRNA transfiziert wurden. Hier ist P = 0,5075, 0,0030, 0,7566, 0,1347, 0,0120, 0,7941 und 0,0156 für si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3 und si-Ly6c2 vs. si-NT, jeweils. f bEnd.3-Zellen wurden 72 Stunden lang mit 50 nM der angegebenen siRNA transfiziert, mit 10 MOI LACV infiziert und konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um LACV-Infektion (grün), Aktin (rot: Phalloidin) und Kerne (blau: Hoechst) abzubilden. a, b Es wurden mehrere zweiseitige gepaarte t-Tests und c–e mehrere zweiseitige ungepaarte t-Tests zwischen si-NT und den Zielgenen durchgeführt (*P < 0,05, **P < 0,01, *** P < 0,001 und ****P < 0,0001) und Mittelwert ± SD (3–6 Proben pro Bedingung) werden angezeigt. d, f Bilder sind repräsentativ für 25–75 unabhängige Felder. Maßstabsbalken = 100 µm (weiß, für normale Bilder), Maßstabsbalken = 10 µm (gelb, für vergrößerte Bilder).

Wir haben auch mutmaßliche Suszeptibilitätsfaktoren zur Validierung in der Primärkultur getestet (Gruppe2-Gene: Cldn2, Tjp2, Cldn5, Vegfa, Mmp8, Mmp25 und Gsn). Der Abbau von Mmp25, einem entwöhnungsverstärkten Gen, führte zu einer verringerten LACV-Intensität sowohl bei erwachsenen als auch entwöhnten primären BCECs (Abb. S4), was darauf hindeutet, dass dieses Wirtsgen die LACV-Infektion erleichtern könnte. Für die anderen mutmaßlichen Anfälligkeitsfaktoren in primären BCECs wurden jedoch nur marginale Auswirkungen beobachtet. Da wir eine höhere Häufigkeit der Treffervalidierung für Gene der Gruppe 1 in Primärzellen beobachteten, konzentrierten wir uns für die weitere Analyse auf Gene dieser Gruppe.

Um die Mechanismen der Virushemmung aufzuklären, verwendeten wir als Nächstes die bEnd.3-Zellen, um die Stadien zu untersuchen, in denen eine Störung der mutmaßlichen Restriktionsfaktoren die Virusreplikation einschränken könnte. Bindungs-/Eintrittstests (Induktion der Virusbindung bei niedriger Temperatur, siehe Abschnitt „Methoden“) zeigten, dass zwei Gene, Ly6c2 und Ifitm3, den Viruseintritt einschränkten (Abb. 3c). Im Vergleich zu si-Ly6c2 führte der Abbau von si-Ifitm3 zu einer geringeren Hochregulierung der Anzahl infizierter Zellen sowie der LACV-Intensität/Zelle (Abb. 3c, d). Anschließend führten wir Plaque-Assays durch und stellten fest, dass die Störung von Ly6c2, Gja1 und Efna2 die Virusproduktion bei 24 hpi erhöhte (Abb. 3e).

In unserem primären Screening hatten wir festgestellt, dass der Abbau des H2q6-Gens auch die Bildung einer synzytienähnlichen Aggregation in bEnd.3-Zellen induziert (ergänzende Abbildung 3a, b). Um dies weiter zu untersuchen, wurden Kontroll- und H2q6-gestörte bEnd.3-Zellen gleichzeitig auf LACV und F-Aktin gefärbt. Es wurde bereits früher berichtet, dass Aktin-Zytoskelettproteine ​​in OB-BCECs nach einer LACV-Infektion verändert sind16. Wir beobachteten, dass LACV mit dem Aktinnetzwerk in Kontrollzellen kolokalisierte, insbesondere an der Zellperipherie und an lamellipodialen Erweiterungen (dünner Pfeil, oberes Feld, Abb. 3f). Im H2q6-Knockdown-Zustand beobachteten wir jedoch, insbesondere in Zellen mit zwei oder mehr Kernen (die eine synzytienartige Aggregation bilden), eine Störung der regelmäßigen, filamentösen Aktinfärbung und der körnigen Färbung von Aktin und LACV, die sich um Zellkerne herum befinden (dicker Pfeil, unteres Feld). , Abb. 3f), was auf eine mögliche Veränderung des Virushandels hindeutet. Daher deutet die In-vitro-Validierung der mutmaßlichen viralen Restriktionsfaktoren (Efna2, H2q6, Clec4e, Gja1, Ifitm3), die in unserem fokussierten siRNA-Screening identifiziert wurden, auf eine mögliche Rolle ausgewählter Wirtsgene bei der Einschränkung oder Veränderung des Viruseintritts, des Transports oder der Freisetzung viraler Partikel in LACV hin -infizierte Endothelzellen.

Eines der primären Gene, das die LACV-Infektion von Endothelzellen signifikant beeinflusste, war Efna2, das in erwachsenen BCECs von Natur aus häufig vorkommt. Das kodierte EFNA2-Protein ist ein angiogener Faktor23, der Signalreaktionen über Rezeptoren der Klasse EphrinA (EphA) ausführt24. Um EFNA2 weiter zu untersuchen, haben wir getestet, ob rekombinantes Maus-EFNA2-Protein (rec-EFNA2) die LACV-Infektion bei entwöhnten und erwachsenen primären BCECs einschränken kann. Entwöhnte und erwachsene primäre BCECs wurden kultiviert, mit LACV infiziert (10 Infektionsmultiplizitäten; abgekürzt als MOI) und dann bis zu 72 Stunden nach der Infektion in EFNA2-konditioniertem Medium oder Kontrollmedium gehalten. Es wurden zwei verschiedene EFNA2-Konzentrationen verwendet, niedrig (2 ug/ml) oder hoch (20 ug/ml). Nach der Behandlung mit rec-EFNA2 zeigten entwöhnte BCECs bei 24 hpi eine verringerte LACV-Infektionsrate, was für die hohe Konzentration von EFNA2 von Bedeutung war (Abb. 4a). Die erwachsenen BCECs, die bereits weitgehend resistent gegen eine LACV-Infektion waren, zeigten einen teilweisen, aber keinen signifikanten Rückgang der Infektion. Daher kann exogen zugesetztes EFNA2 die In-vitro-LACV-Replikation in entwöhnten BCECs einschränken (Abb. 4a).

a Wirkung von rekombinantem EFNA2 (2 µg/ml bis 20 µg/ml) auf die LACV-Infektionsraten bei entwöhnten und erwachsenen BCECs bei 24 und 72 hpi (N = 4–12 Einzelproben, Daten gesammelt auf der Grundlage von 25 Bildern für jede Probe, P = 0,1654 und 0,0475 für 2 µg/ml und 20 µg/ml im Vergleich zur Kontrolle bei entwöhnten BCECs und P = 0,1068 und 0,0846 für 2 µg/ml und 20 µg/ml im Vergleich zur Kontrolle bei erwachsenen BCECs. b Erwachsene Efna2–/– (m), Efna2+/– (m) und WT-Mäuse wurden mit 105 PFU LACV (IP) infiziert und der Prozentsatz neurologischer Mäuse wird angezeigt. Siehe Suppl. Tabelle 3 für gemischte Efna3/5-Genotypen von Efna2−/− (m) und Efna2+/− (m) Mäusen (N = 22 WT- oder Efna2+/− (m) Mäuse und N = 18 Efna2−/− (m) Mäuse, P = 0,0105). c LACV-RNA-Spiegel im Gehirn infizierter Mäuse bei 8–22 dpi (NC: nichtklinische Mäuse und C: klinische Mäuse, wobei N = 18 WT oder Efna2+/− (m) NC-Mäuse, N = 2 WT oder Efna2+/− (m ) C-Mäuse, N = 10 Efna2−/− (m) NC-Mäuse und N = 8 Efna2−/− (m) C-Mäuse). Hier gilt P = 0,0008 sowohl für WT/ Efna2+/− (m) C als auch für Efna2−/− (m) C im Vergleich zur WT/ Efna2+/− (m) NC-Kontrolle. d Gefäßleckage, bewertet durch Messung der viralen RNA in LACV-infizierten Efna2−/− (m)- und WT-Mäusegehirnen bei 3 dpi (N = 8 Mäusegehirne für jeden analysierten Zustand). e Bildgebung zur Erkennung von Gefäßleckagen in Hirnschnitten von LACV-infizierten WT- und Efna2−/− (m)-Mäusen bei 3 dpi (Pfeil, FluoSphere-Perlen: rot, Hoechst: blau). Dicke Pfeile stellen die Lokalisierung von FluoSphere-Perlen an der ZNS-Peripherie bei WT-Mäusen dar, während die dünnen Pfeile das Austreten von FluoSphere-Perlen in das Gehirnparenchym bei Efna2−/− (m)-Mäusen darstellen (1 von 4 Mäusen zeigte ein Austreten, was hier dargestellt ist). (a, einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Post-hoc-Dunnett-Test, b, Mantel-Cox-Log-Rank-Test und c, d mehrere ungepaarte, zweiseitige t-Tests, *P < 0,05, **P < 0,01 und *** P < 0,001).Maßstabsbalken = 100 um.

Um zu untersuchen, ob Efna2 eine Rolle bei der Einschränkung der LACV-Infektion des ZNS in vivo spielt, analysierten wir die Entwicklung neurologischer Erkrankungen bei normal resistenten erwachsenen Mäusen, denen Mitglieder der Efna-Familie fehlen. Wir haben zunächst > 6 Wochen alte Mäuse mit gemischten Mangelgenotypen für Efna2, Efna3 und Efna5 (Efna2–/– gemischt; abgekürzt als Efna2–/– (m)) getestet, wie in der Ergänzungstabelle 3 beschrieben. Alle Mäuse wurden in zwei Gruppen aufgeteilt : homozygot für Efna2-Mangel mit gemischten +/+, +/− oder −/− Genotypen für Efna3 und Efna5 (Efna2−/− (m) oder heterozygot für Efna2-Mangel mit gemischten +/+, +/− oder −/− Genotypen für Efna3 und Efna5 (Efna2+/− (m)) sowie Wildtyp-Mäuse mit Efna2+/+3+/+5+/+-Genotyp (Wildtyp, abgekürzt als WT). Nach der Inokulation von 105 PFU/Maus etwa 50 % von Efna2–/– (m) Mäuse entwickelten eine neurologische Erkrankung, unabhängig von ihrem Efna3- oder Efna5-Genotyp (Ergänzungstabelle 3). Im Gegensatz dazu zeigten die meisten WT- oder Efna2+/– (m) Mäuse (~ 91 %) keine Anzeichen einer neurologischen Erkrankung (Abb. 4b). Wir beobachteten auch hohe Viruskonzentrationen bei den Efna2 −/− (m) Mäusen mit klinischer (C) neurologischer Erkrankung im Vergleich zu nichtklinischen (NC) Mäusen (Abb. 4c). Somit ist Efna2 scheint eine hemmende Rolle bei der LACV-Pathogenese in vivo zu spielen (Abb. 4b, c).

Um festzustellen, ob ein Efna2-Mangel die BHS-Permeabilität und die LACV-Neuroinvasion beeinflusst, untersuchten wir Mäuse vier Tage vor dem Einsetzen der klinischen Symptome bei 3 dpi. LACV-RNA wurde in etwa der Hälfte der Efna2 −/− (m)-Mäuse nachgewiesen, jedoch nur in einer Maus aus der WT- und Efna2+/− (m)-Gruppe (Abb. 4d). Diesen LACV-infizierten Efna2−/− (m) Mäusen wurden außerdem ~100 nm rote FluoSphere-Kügelchen (Partikel in Virusgröße; rote Färbung) bei 3 dpi injiziert, um Gefäßleckagen zu überwachen. Fluorosphären wurden hauptsächlich in ZNS-Blutgefäßen bei WT-Mäusen nachgewiesen (dicke weiße Pfeile). Bei einer der vier Efna2-/−-Mäuse wurden jedoch Fluorkügelchen im Gehirnparenchym nachgewiesen (dünne weiße Pfeile, Abb. 4e), was auf eine frühe Gefäßleckage schließen lässt. Somit korrelierte die um 25–50 % erhöhte Erkrankung bei Efna2−/− (m)-Mäusen mit einer erhöhten Inzidenz früher viraler RNA-Erkennung im ZNS und der Erkennung von Gefäßlecks bei einer Untergruppe dieser Mäuse. Diese Daten deuten darauf hin, dass Efna2 bei erwachsenen Mäusen ein wichtiger Restriktionsfaktor sein könnte, um eine LACV-Neuroinvasion zu verhindern.

Um zu klären, ob Efna2 selbst der primäre Mediator der Virusrestriktion war, verglichen wir die LACV-Anfälligkeit bei erwachsenen (> 6 Wochen alten) WT- und Efna2-/-3+/+5+/+-Mäusen (Efna2 Single Knockout (KO); abgekürzt als). Efna2−/−(s)). Wie erwartet waren die erwachsenen WT-Mäuse gegenüber einer LACV-Dosis von 105 PFU/Maus nicht anfällig (~96 % nicht neurologisch). Im Gegensatz dazu entwickelten etwa 38 % der erwachsenen Efna2−/−(s)-Mäuse als Reaktion auf eine LACV-Infektion eine neurologische Erkrankung (Abb. 5a). Darüber hinaus wiesen aus Efna2−/−(s)-Mäusen isolierte Mikrogefäßfragmente im Vergleich zu WT bei 24 und 48 hpi ein höheres Maß an LACV-Infektion auf (Abb. 5b, d) und verringerten die Überlebensrate bei 72 und 96 hpi (Abb. 5c). Wir untersuchten auch die Gefäßleckage in vivo mithilfe von Fluorosphären bei WT- und Efna2−/− (s)-Mäusen unter Verwendung eines etwas späteren Zeitpunkts von 5 dpi. Erwachsene WT-Mäuse zeigten keine Gefäßleckage, während bei Efna2−/− (s)-Mäusen 1–3 fluoreszierende Kügelchenherde im Gehirnparenchym konsistent nachgewiesen wurden (Abb. 5e, 5 von 7 Mäusen). Somit waren Efna2−/− (s)-Mäuse anfälliger für LACV-induzierte neurologische Erkrankungen, die mit einer Zunahme der Gefäßleckage im ZNS vor Ausbruch der Erkrankung korrelierten. Dies korrelierte auch mit einer erhöhten Virusinfektion und einem verringerten Zellüberleben in Efna2−/− (s) BCECs im Vergleich zu WT BCECs (Abb. 5b, c). Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass Efna2 eine wichtige Rolle bei der BHS-Integrität während einer LACV-Infektion spielt.

ein Vergleich der LACV-induzierten (105 PFU/Mausdosis (IP)) neurologischen Erkrankung bei erwachsenen WT- und Efna2-/-Mäusen. (*P < 0,05, ****P < 0,0001, Mantel-Cox-Log-Rank-Test, N = 28 WT-Mäuse und N = 43 Efna2−/− Mäuse, P = 0,0013). b Vergleichende Infektion von BCECs nach LACV-Infektion (10 MOI) bei 24 und 48 hpi auf WT- und Efna2−/−-Primär-BCECs (N = 33 und N = 18 für WT und Efna2−/− BCECs, Mittelwert ± SD ist dargestellt, P < 0,0001 und P = 0,0041 für 24 bzw. 48 PSi). c Vergleichende Zelllebensfähigkeit (validierte Kernzahl) von BCECs nach LACV-Infektion (10 MOI) bei 72 und 96 hpi auf WT- und Efna2-/−-Primär-BCECs (N = 24 und N = 12–18 für WT- und Efna2-/−-BCECs). , Mittelwert ± SD wird angezeigt, P < 0,0001 und P = 0,0304 für 72 bzw. 96 hpi). Alle einzelnen Datenpunkte werden angezeigt und die statistische Signifikanz durch mehrere zweiseitige ungepaarte t-Tests analysiert (*P < 0,05, **P < 0,01 und ****P < 0,0001). d Repräsentative Bilder bei 24 und 48 hpi zum Vergleich von WT- und Efna2-/-BCECs (Hoechst: Blau und LACV: Grün). Maßstabsbalken = 100 um (Bilder sind repräsentativ für 25 Einzelbilder/Probe). e Ein repräsentativer WT-Gehirnschnitt (ohne Gefäßleckage) wird zusammen mit 5 Efna2−/−-Gehirnschnitten gezeigt, die Gefäßleckage zeigen (Hoechst: blau und FluoSphere-Perlen: rot und Maßstabsbalken = 100 um) (N = 5 WT-Gehirne und N = 7 Efna2−/−-Gehirne, von denen 5 Gehirne wahrscheinliche Herde einer Gefäßleckage aufwiesen). Die Anzahl der Herde/Gehirne wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests (P = 0,0195) verglichen.

Da der Abbau von Gja1 (das das Cx43-Protein exprimiert) die LACV-Infektion in vitro beeinflusste, stellten wir die Hypothese auf, dass die Aktivierung oder Hochregulierung von Cx43 die Virusinfektion und Pathogenese reduzieren könnte. 4-Phenylbuttersäure (4-PBA) ist ein bekannter Aktivator und Kanalbildungsverstärker für mehrere Connexine, einschließlich Cx43. Wir haben bEnd.3-Zellen mit LACV +/− 4-PBA infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten auf LACV und Cx43 immungefärbt. Die Behandlung mit 4-PBA reduzierte die LACV-Infektion signifikant und erhöhte das Überleben der Wirtszellen bei 96 hpi (Abb. 6a). Mittels konfokaler Mikroskopie beobachteten wir, dass die Verringerung der LACV-Infektion (LACV: grün) bei 96 hpi mit einer Verstärkung der Cx43-Puncta-Bildung (Cx43: rot) korrelierte. Der Anstieg der Cx43-Puncta-Bildung (weiße Pfeile; gekennzeichnet durch körnige oder laminare Cx43-Färbung) oder die Lokalisierung in Richtung der Zelloberfläche war von der 4-PBA-Dosis abhängig (Abb. 6b)25. Wie in früheren Studien25 beobachtet, kam es zu einer Hochregulierung des Cx43-Proteinspiegels bestätigt durch Western Blot (Abb. 6c). Somit korrelierte die durch 4-PBA induzierte Hochregulierung der Cx43-Proteinspiegel oder der Puncta-Bildung mit der Hemmung einer LACV-Infektion in vitro.

a, b LACV-infizierte (10 MOI) bEnd.3-Zellen wurden mit 4-PBA (0–10 mM) und bei verschiedenen HPI behandelt und abgebildet, um (a) die Virusintensität oder die virusinduzierte Zelldepletion (N = 4) zu messen Proben, gesammelte Daten basierend auf 25 Bildern, die von jeder Probe erhalten wurden, und der Mittelwert mit SD wird angezeigt) oder (b) Lokalisierung von Cx43 (rot), LACV (grün) und Hoechst (blau) (repräsentativ für ~12–25 Bilder, die für jede Bedingung erhalten wurden , P = 0,1142, < 0,0001 und 0,0097 von PBA 2,5, 5 und 10 mM, im Vergleich zu PBA 0 mM). Weiße Pfeile stellen eine punktförmige Färbung von Cx43 dar. c Western Blot und densitometrische Analysen der Cx43-Proteinspiegel in 4-PBA-behandelten bEnd.3-Zellen. Gapdh ist ein Ladekontroll- und Normalisierungsfaktor für die Quantifizierung (N = 3 für jede Bedingung und Mittelwert mit SD wird angezeigt, P = 0,7647, 0,0043 und 0,4589 für PBA 2,5, 5 und 10 mM, diese werden mit PBA 0 mM verglichen). d Entwöhnte Mäuse, die mit 2000 PFU LACV infiziert waren, wurden bis zum 5 dpi mit Vehikel (LV) oder 500 mg/kg-Tag 4-PBA (LP) behandelt und auf den neurologischen Endpunkt untersucht (N = 9 Mäuse für jede Erkrankung, P = 0,0074). e Wirkung der 4-PBA-Behandlung auf die Korrelation zwischen LACV- und Gja1-Expression im Gehirn von Mäusen bei 3 dpi (N = 9 LV- und N = 11 LP-Gehirn-RNA-Proben von Mäusen, P = 0,0311 und 0,0147 für LACV- und Gja1-Vergleich). f Wirkung von 4-PBA auf den Eintritt und die Lokalisierung von LACV, wie durch konfokale Bildgebung von Mäusegehirnschnitten bei 4 dpi beurteilt (rot: ZO1, grün: LACV, blau: Hoechst/Kerne). (a) Zweifaktorielle ANOVA gefolgt von Dunnett-Test und alle Gruppen wurden mit dem Vehikel für die gleiche Zeit pi verglichen, (b) Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnett-Test, einzelne Punkte stellen separate Bildfelder dar, (c) mehrfach, zweiseitig ungepaarte t-Tests, d Mantel-Cox Log-Rank-Test und e, zweiseitiger ungepaarter t-Test mit *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 und N = 3–4 für jedes Experiment. Maßstabsbalken = 100 µm (weiß, für normale Bilder), Maßstabsbalken = 10 µm (gelb, für vergrößerte Bilder).

Um zu untersuchen, ob 4-PBA LACV-induzierte neurologische Erkrankungen hemmen kann, wurden LACV-infizierte entwöhnte Mäuse (ca. 21–23 Tage alt) täglich mit 500 mg/kg 4-PBA von 0 bis 5 dpi (IP-Injektion, LP) behandelt. Mit LACV infizierte und mit Vehikel behandelte Mäuse (LV) wurden parallel analysiert. Die LV-Mäuse zeigten neurologische Erkrankungen zwischen 6 und 8 dpi. Im Gegensatz dazu kam es bei LP-Mäusen zu einer verzögerten Entwicklung neurologischer Erkrankungen (Abb. 6d). Am neurologischen Endpunkt waren die Virusspiegel und die Gja1-mRNA-Expressionsspiegel in den mit Vehikel und 4-PBA behandelten Gruppen ähnlich (ergänzende Abbildung 5). Eine frühere Analyse bei 3 dpi, als das Virus zum ersten Mal in das ZNS eindrang, zeigte jedoch, dass LP-Tiere verringerte Viruskonzentrationen aufwiesen, was mit einem Anstieg der Gja1-mRNA-Expression korrelierte (Abb. 6e). Bei 4 dpi wurden Gehirne von LV- und LP-Mäusen isoliert und gemeinsam auf die Endothelmarker ZO1 und LACV gefärbt. LV-Mäuse zeigten eine anhaltende und deutliche LACV-Färbung in der OB- und OT-Region des Gehirns (Abb. 6f; obere Felder). Im Gegensatz dazu hatten mit 4-PBA behandelte Mäuse entweder kein nachweisbares LACV (3 von 4 Mäusen) oder eine viel geringere Virusfärbung (1 von 4 Mäusen (Abb. 6f; untere Felder)) im Vergleich zu Vehikelkontrollen. Bilder mit höherer Vergrößerung zeigten eine deutliche LACV-Infektion im Hirnparenchym in einem stark vaskularisierten Bereich bei LV-Mäusen, wohingegen die LACV-Infektion bei LP-Mäusen hauptsächlich auf das Gefäßlumen bei 4 dpi beschränkt war (Abb. 6f, rechte Seitentafel). Bemerkenswerterweise waren die Viruspartikel in den Gefäßen eingeschränkt, ohne dass bei 4 dpi eine ausreichende Leckage im Hirnparenchym festgestellt wurde. Somit induzierte die 4-PBA-Behandlung eine Hochregulierung von Cx43 und konnte die Virusinfektion und -verbreitung in der OB/OT-Region im Frühstadium der LACV-Infektion teilweise einschränken.

Die altersbedingte Anfälligkeit für eine LACV-Infektion hängt teilweise von der Fähigkeit des LACV ab, eine Gefäßleckage zu induzieren und Zugang zum ZNS zu erhalten16. In dieser Studie haben wir einen systematischen „Screening-to-Targeting“-Ansatz gewählt, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen entwöhnten und erwachsenen Mikrogefäßfragmenten (ex vivo)/BCECs (in vitro) aufzudecken, die zur unterschiedlichen LACV-Anfälligkeit beitragen können. Die transkriptomischen Analysen zeigten, dass Gene in mehrere altersspezifische, immunbezogene oder hirnortsspezifische Gruppen eingeteilt werden können. Anschließend verwendeten wir eine gezielte siRNA-Bibliothek, um die Rolle dieser Faktoren bei der Kontrolle von Virusinfektionen und dem damit verbundenen Zelltod zu untersuchen. Durch das Folgescreening, die Validierungsstudie und mechanistische Analysen haben wir mehrere Gene, hauptsächlich Restriktionsfaktoren, gefunden, die für die Kontrolle von LACV-induzierter Gefäßleckage bei Erwachsenen wichtig sein könnten und therapeutische Ziele zur Verbesserung der LACV-Resistenz bei Kindern darstellen könnten.

Ein vorhersehbarer Weg in diesem Modell der BCEC-Leckage wäre die Veränderung von TJ-Proteinen gewesen. Mehrere Viren, darunter das Hepatitis-C-Virus und das Dengue-Virus, nutzen TJs, um in die Zelle einzudringen26, wohingegen LACV-Eintrittsfaktoren weitgehend unbekannt sind21,27. In unserem primären Screening führte der Abbau der TJs Cldn2 und Cldn5 zu einer verringerten LACV-Infektion, wohingegen der Abbau von Cldn1 keinen signifikanten Effekt zeigte. Der Einfluss dieser Gene wurde jedoch in einer Monoschichtkultur ohne bloßen Stress untersucht. Da die Konformation von BCECs in den Blutgefäßen in vivo sehr wichtig ist, könnte die Störung von TJs zum Eintritt von LACV in die anfälligen Zellen beitragen. In diesem Zusammenhang stellten wir fest, dass die Veränderung der GJ-Expression ein wichtiger Faktor zur Kontrolle der LACV-Infektion und der Schädigung von BCECs sein könnte. Wir haben insbesondere beobachtet, dass eines der wichtigsten endothelialen GJ-Proteine ​​des Gehirns, Cx43, das von Gja1-mRNA28 exprimiert wird, bei der Kontrolle der LACV-Infektion in bEnd.3-Zellen hilft.

Anhand der RNA-Sequenz, des gezielten siRNA-Screenings und anderer Folgeanalysen haben wir mehrere Gene untersucht, die nicht direkt an der Aufrechterhaltung der Zellverbindungen beteiligt sind, darunter Bst1, Clec4e, Efna2, H2q6, Ifitm3 und Ly6c2. Obwohl Bst1 ein Marker für endotheliale Stammzellen mit regenerativen Eigenschaften ist29 und in entwöhnten BCECs weit verbreitet ist, hatte dieses Gen in unserer Studie keine wesentliche regulatorische Funktion. Gut charakterisierte Immunregulatoren wie Clec4e, H2q6 und Ifitm3 spielen eine definierte Rolle bei LACV oder anderen Virusinfektionen. Clec4e induziert in unserer Studie eine antivirale Reaktion gegen LACV21 und begrenzt die Virusinfektion und Plaqueproduktion (teilweise)30. H2q6, ein Teil der MHC-Klasse I, hat wichtige Funktionen bei der Antigenpräsentation30 und moduliert insbesondere in Endothelzellen das Aktin-Zytoskelett-Netzwerk und Zellüberleben31,32. Eine LACV-Infektion kann zu einem Umbau des Aktin-Netzwerks führen16, der mit zytopathischen Effekten verbunden sein kann, die in kultivierten BCECs beobachtet werden17. Interessanterweise führte der Abbau von H2q6 zu einer höheren Virusinfektion und einer synzytienähnlichen Aggregationsbildung, die mit der Fragmentierung von F-Aktin verbunden war. Ifitm3 ist ein bekannter viraler Restriktionsfaktor, der den Eintritt33 oder die pH-abhängige Fusion34 blockiert. Dementsprechend führte der Abbau von Ifitm3 zu einer höheren LACV-Infektionsintensität in BCECs mit einer höheren Anzahl infizierter Zellen. Obwohl endotheliales Ly6c2 bisher keine Rolle bei Virusinfektionen spielt, beobachteten wir eine Verstärkung der viralen Anheftung/Eintritt, Infektion, Replikation und Verbreitung von LACV mit Ly6c2-Knockdown. Obwohl wir uns bei unserer Folgeanalyse auf mutmaßliche Restriktionsfaktoren konzentrierten, war Mmp-25 der einzige mutmaßliche Suszeptibilitätsfaktor mit entwöhntem BCEC, dessen Unterdrückung die Virusinfektion in primären BCECs reduzierte, was möglicherweise eine weitere Analyse rechtfertigt. Insgesamt legen diese Beobachtungen nahe, dass die altersspezifische LACV-Anfälligkeit von BCECs durch ein komplexes multigenes Netzwerk von Faktoren gesteuert wird, die die Wirtsresistenz bei Erwachsenen fördern.

Unter diesen Faktoren zeigte adultes verstärktes Efna2 einen besonderen Phänotyp bei der Kontrolle viraler Infektionen in bEnd.3-Zellen und primären BCECs sowie bei der viralen Plaqueproduktion. Efna2 ist ein Signalmolekül, das zur Ephrin-Familie (Efn) gehört und über verwandte Eph-Rezeptor-Interaktionen an der Angiogenese und der Aufrechterhaltung von Endothelzellen beteiligt ist. Kürzlich wurde festgestellt, dass Efna2 eine Rolle spielt, von der neuronalen Entwicklung, Differenzierung und Migration35,36,37 bis hin zur Angiogenese und Krebsmetastasierung23. In unserer Studie beobachteten wir, dass die direkte Behandlung von BCECs mit rec-EFNA2 die Virusinfektion in vitro reduzierte. Die erste Beobachtung einer erhöhten LACV-Anfälligkeit erwachsener Efna2-/- (m)-Mäuse mit gemischtem Efna3/5-Mangel deutete darauf hin, dass die EphrinA-Moleküle möglicherweise eine Rolle bei der Resistenz gegen LACV-induzierte neurologische Erkrankungen spielen. Dies wurde durch die beobachtete Anfälligkeit von Efna2−/− (s)-Einzel-KO-Mäusen weiter bestätigt, was darauf hindeutet, dass das Efna2-Gen ein entscheidender Faktor für die LACV-Resistenz bei erwachsenen Mäusen ist. In ähnlicher Weise waren die aus Efna2–/– (s)-Mäusen isolierten BCECs anfälliger für eine In-vitro-LACV-Infektion und einen infektionsinduzierten Zelltod. Außerdem zeigte eine signifikante Anzahl von LACV-infizierten Efna2−/−(s)-Mäusen das Austreten virusgroßer Partikel in das ZNS-Parenchym. Dies deutet darauf hin, dass Efna2 eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Virusresistenz spielt. Ob Efna2 für therapeutische Zwecke in vivo gezielt eingesetzt werden könnte, wird ein wichtiges Thema für zukünftige Untersuchungen sein.

Wie bereits erwähnt, sind CJ-Proteine ​​Hauptziele für die Regulierung des Viruseintritts durch die BHS, und wir haben das Gja1-Genprodukt Cx43 als weiteren potenziellen Restriktionsfaktor identifiziert. Frühere Studien haben gezeigt, dass Viren wie das Rous-Sarkom-Virus38, HIV39 oder eine Maus-Hepatitis-Virus-Infektion40,41 die Cx43-Expression und -Funktion in verschiedenen Zelltypen modulieren können. Bei einer Infektion mit dem klassischen Schweinepestvirus kam es ebenfalls zu einer Abreicherung von Cx43 in Endothelzellen42. Die Rolle von Cx43 und die Frage, ob seine Verstärkung eine Bunyavirus-Infektion begrenzen könnte, wurden jedoch bisher nicht untersucht. Mit dem Ziel, den Virusaustritt bei anfälligen Absetztieren zu reduzieren, verwendeten wir 4-PBA, einen bekannten und gut charakterisierten kleinen Molekülaktivator von Cx4343. 4-PBA reguliert ein luminales endoplasmatisches Retikulum (ER)-Protein mit 29 kDa (ERp29)44,45 hoch, das die Biosynthese und den Transport von Cx4346 steuert. Während noch geklärt werden muss, ob die Aktivierung von Chaperonen wie ERp29 der zugrunde liegende Mechanismus der 4-PBA-induzierten Reduktion von LACV in BCECs ist, stellt diese Strategie einen vielversprechenden Ansatz zur Bekämpfung der LACV-induzierten Enzephalitis dar. Es ist bemerkenswert, dass die Verabreichung von 4-PBA zu Beginn der Virusexposition ausreichte, um den Viruseintritt und die neurologischen Symptome zu verringern, was auf eine besonders schnelle Reaktion auf dieses potenzielle Therapeutikum hinweisen könnte.

Zusammenfassend haben wir einen systematischen Transkriptom- und Genstörungs-Screening-Ansatz verwendet, um Gene oder Genprodukte zu identifizieren, die an der Kontrolle der LACV-Anfälligkeit von BCECs und infektionsbedingten Gefäßlecks beteiligt sind. Wir identifizierten EFNA2 und Cx43 als zwei wichtige Faktoren, die die erwachsenenspezifische Resistenz gegen LACV-Infektionen unterstützen. Die Identifizierung zweier verschiedener molekularer Regulatoren, die an der Regulierung der LACV-Neuroinvasion beteiligt sind, lässt auf einen Synergismus zwischen mehreren Effektoren schließen, die Unterschiede zwischen der unreifen und reifen Blut-Hirn-Schranke regulieren, die sich auf die Fähigkeit von Viren wie LACV auswirken, Zugang zum ZNS zu erhalten und neuroinvasive Erkrankungen zu verursachen.

Alle Tierstudien wurden gemäß den Tierprotokollen RML-2018-018-E, LISB 3E und LISB 4E unter Einhaltung der Grundsätze der Labortierpflege und in Übereinstimmung mit und Genehmigung des NIH/NIAID/RML Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt. In dieser Studie wurden keine menschlichen Proben verwendet. Der Temperaturbereich sowohl im Tierkäfig als auch im Tierhaltungsraum betrug 20–24 °C und die Luftfeuchtigkeit 30–70 %. Es wurde jederzeit ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus (6–18 Uhr) eingehalten. Alle Mäuse wurden nach dem Experiment eingeschläfert.

Entwöhnte (ca. 3 Wochen alt) und erwachsene (> 6 Wochen alte) Mäuse wurden mit 100 µg Poly I:C (HMW), verdünnt in einer 0,5 mg/ml LyoVec-Transfektionsreagenzlösung (Invivogen), über ein 100 µl Retroorbital (IV ) Injektion. Das LyoVec-Reagenz wurde mit dem bereitgestellten entionisierten sterilen Wasser gemäß den Empfehlungen des Herstellers rekonstituiert und allein als Vehikelkontrolle verwendet. Mikrogefäßfragmente wurden 3 Stunden nach der Injektion aus behandelten Tieren und Vehikeltieren entfernt. Zum Vergleich der Transkriptexpression von OB- und CT-Mikrogefäßfragmenten unter LACV- und Scheininfektionsbedingungen wurden entwöhnte C57BL/6-Mäuse mit einer IP-Dosis von 2000 PFU LACV, verdünnt in 200 μl sterilem PBS pharmazeutischer Qualität, infiziert. Scheinmäuse erhielten ein äquivalentes Volumen an nicht infiziertem Vero-Überstand, verdünnt in PBS. Mikrogefäßfragmente aus OB und CT wurden aus LACV- und scheininfizierten Mäusen bei 3 dpi isoliert. RNAs wurden wie unten beschrieben aus Mikrogefäßfragmenten extrahiert und unter Verwendung von Agencourt RNAClean XP-Perlen (Beckman Coulter, Brea, CA) gereinigt. Die RNA-Konzentration wurde mithilfe der RiboGreen-Fluoreszenz-RNA-Quantifizierungsmethode (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) gemessen. Die Reinheit und Integrität der RNA wurde mithilfe der Nanodrop 8000 UV-Spektrophotometrie (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) bzw. des Bioanalyzer RNA 6000 Pico-Chip-Assays (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) bewertet. Sequenzierungsbibliotheken wurden aus 115 ng (Adult/Entwöhnung) oder 170 ng (OB/CT) RNA mit dem TruSeq Stranded mRNA-Probenvorbereitungskit gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll (Illumina, Inc., San Diego, CA) generiert. Die endgültigen, gereinigten TruSeq-Bibliotheken wurden mit dem Kapa SYBR FAST Universal qPCR-Kit für die Illumina-Sequenzierung (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) quantifiziert, auf 2 nM verdünnt und gleichmäßig gepoolt. Bibliotheken wurden auf dem HiSeq 2500-Instrument unter Verwendung des TruSeq Rapid PE Cluster-Kits und des Rapid 200 Cycle SBS-Kits (Illumina, Inc., San Diego, CA) sequenziert.

Adaptersequenzen wurden mit CutAdapt47 aus rohen Fastq-Dateien entfernt und mit dem FASTX-Toolkit 0.0.14 (Hannon Lab, CSHL, RRID:SCR_005534) qualitätsgefiltert und gekürzt. Qualitätsgefilterte und getrimmte Lesevorgänge wurden mithilfe von Hisat2 Version 2.1.0 mit den Parametereinstellungen –no-unal –no-mixed48 auf die Mausreferenzsequenz GRCm38 abgebildet. Die Alignment-Dateien wurden als Eingabe für HTSeq-count der Python-Bibliothek HTSeq Version 0.9.149 verwendet, um mithilfe der GRCm38-Referenzanmerkungsdatei die Anzahl der Gene zu generieren. Die Rohzählungsmatrizen wurden als Eingabe für die Differentialausdrucksanalyse mit DESeq250 verwendet. Die Gene wurden nach DESeqs Shrunken Log Fold Change (LFC) und dem angepassten p-Wert eingestuft. Die erfassten Daten wurden nach statistischer Signifikanz, Basismittelwert (Leseanzahl der Zielgene) und log2-facher Änderung gefiltert und in R (Version 3.6.0), Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Version 84978992, Qiagen) und SIGNAL (Version 2.0) Software51 zum Verständnis der Wege und Gene, die an altersabhängigen immunstimulierenden Wirkungen auf Mikrogefäße im Gehirn beteiligt sind. Durch den Vergleich verschiedener Gruppen wurden etwa 50 Gene für die weitere Analyse bei LACV-Infektionen ausgewählt.

Alle Tierstudien wurden gemäß den Tierprotokollen RML-2018-018-E, LISB 4E und LISB 3E unter Einhaltung der Grundsätze der Labortierpflege und in Übereinstimmung mit und Genehmigung durch das NIH/NIAID/RML oder NIH/NIAID/Bethesda Institutional Animal durchgeführt Pflege- und Nutzungsausschuss. C57BL/6-Mäuse (erhalten von Jackson Laboratories) oder Efna2–/– (m) oder Efna2–/–(s) Mäuse wurden in einer Zuchtkolonie am RML oder Bethesda Campus gehalten. Zur Untersuchung der LACV-Pathogenese in den Mäusen1 wurde menschlicher LACV-Stamm aus dem Jahr 1978 verwendet, ein freundliches Geschenk von Dr. Richard Bennett, der zur Inokulation auf die entsprechende Dosis in 200 µl sterilem PBS pharmazeutischer Qualität verdünnt wurde. Entwöhnte Tiere (ca. 3 Wochen alt) wurden IP mit einer niedrigen Dosis von 2000 PFU/Maus geimpft, während Erwachsene (Alter > 6 Wochen) IP mit 105 PFU geimpft wurden. Schein-inokulierte Mäuse wurden mit 200 μl PBS mit der entsprechenden Menge Zellüberstand von nicht infizierten Vero-Zellen geimpft, um dem Volumen für Virusverdünnungen zu entsprechen. Die gesamten Gehirne oder OB-CT-Regionen wurden getrennt von LACV und scheingeimpften Mäusen bei 3 dpi isoliert. Die Ergänzungstabelle 4 enthält die Abkürzungen der meisten Versuchsgruppen und andere in diesem Manuskript verwendete Nomenklaturen.

Gehirnmikrogefäße wurden wie zuvor beschrieben isoliert und gezüchtet17. Kurz gesagt, nach transkardialer Perfusion mit sterilem PBS wurden ganze Gehirne von entwöhnten und erwachsenen Mäusen isoliert und anschließend in kleine Stücke gehackt. Anschließend wurde ein einstündiger Aufschluss der Gehirnstücke unter Verwendung von 10 mg/ml Kollagenase (CLS2; Worthington Biochemical) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Sigma) in einem Inkubator-Schüttelgerät bei 37 °C durchgeführt. Die verdauten Gewebe wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 1000 g in Gegenwart einer in DMEM hergestellten 20%igen Rinderserumalbuminlösung (BSA) von Zelltrümmern und Lipiden der weißen Substanz getrennt. Eine Lösung von 10 mg/ml Kollagenase/Dispase (Roche Applied Science) in DMEM wurde dem resultierenden Pellet zugesetzt und 45 Minuten bis 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die aus diesem Schritt erhaltenen Mikrogefäßfragmente wurden auf einem 33 % kontinuierlichen Percoll-Gradienten getrennt, der 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert wurde. Schließlich wurden die Mikrogefäßfragmente gesammelt und zweimal in DMEM gewaschen, bevor sie für Ex-vivo- und In-vitro-Experimente verwendet wurden. Für den OB- und CT-Vergleich wurden diese spezifischen Regionen mit einer Pinzette mit feiner Spitze isoliert und das gleiche Protokoll wie oben wurde befolgt, um Mikrogefäßfragmente aus diesen verschiedenen Gehirnregionen zu isolieren.

Die Mikrogefäßfragmente wurden auf Kammerobjektträgern oder Platten mit mehreren Vertiefungen ausplattiert, die mit Kollagen Typ IV (Sigma) und menschlichem Fibronektin (Sigma) beschichtet waren. DMEM, ergänzt mit 20 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Glutamin, 1 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (R&D Systems) und 4 μg/ml Puromycin (Sigma), wurde für die Kultivierung primär inkubierter BCECs verwendet in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2, 95 % Luft und 37 °C. Die Maus-Endothelzelllinie bEnd.3 (ATCC, CRL-2299) wurde auf ähnliche Weise unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % Glutamin, kultiviert. Für In-vitro-Experimente wurden konfluente Monoschichten mit verschiedenen MOIs von LACV (zur Standardisierung) beimpft, und für Experimente wurde ein MOI von 10 verwendet. Nach 1,5 Stunden wurde frisches Medium hinzugefügt und die Zellen wurden zu den gewünschten Zeitpunkten analysiert. Parallel dazu wurden scheininokulierte Proben aufbewahrt.

Die Gesamt-RNA wurde aus ex vivo isolierten Mikrogefäßfragmenten oder kultivierten BCECs mithilfe von RNA-Isolierungskits von Zymo Research und unter Verwendung des Herstellerprotokolls isoliert. Die Gesamt-RNA wurde 30 Minuten lang bei 37 °C mit DNase I (Invitrogen) behandelt und über RNA-Reinigungssäulen (Zymo Research) gereinigt. cDNAs wurden aus gereinigten RNA-Proben unter Verwendung des iScript Reverse Transcription Kit (Bio-Rad Laboratories) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. cDNA-Proben wurden in Rnase-freiem Wasser fünffach verdünnt und diese verdünnten Proben wurden für die Genexpressionsanalyse durch qPCR unter Verwendung von SYBR Green SuperMix mit ROX (Bio-Rad Laboratories) verwendet. Für alle Analysen wurde Gapdh als Housekeeping-Genkontrolle verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt.

Die Gehirne der Mäuse wurden nach der chirurgischen Entfernung bei –80 °C gelagert, bis sie mit dem im Rneasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) bereitgestellten Lysepuffer aufgetaut wurden. Die Gehirne wurden mit einem TissueRuptor (Qiagen) homogenisiert und die RNA-Extraktion erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers und unter Verwendung desselben Kits. Die Konzentration wurde mit einem NanoDrop 1000-Spektrophotometer (Thermo Scientific) gemessen und die cDNA wurde mit einem iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories) synthetisiert. Die gleiche Menge an cDNA wurde für die Echtzeit-PCR unter Verwendung des SYBR Green Assay-Systems (Applied Biosystems) zur Messung der LACV-RNA oder des TaqMan Real-Time PCR-Assays (Thermo Scientific) zum Nachweis von Gja1 unter Verwendung des Herstellerprotokolls verwendet. Es wurden geeignete Housekeeping-Genkontrollen vorgenommen und die CT-Werte mit einem QuantStudio 6 Flex-Gerät (Applied Biosysterms) oder einem Applied Biosystems ViiA 7-System gemessen. Zur Extraktion der Daten wurde die QuantStudio Real-Time PCR-Software verwendet.

Die bEnd.3-Zellproteine ​​wurden mit 96 hpi (10 MOI der LACV-Inokulumdosis) unter Verwendung von RIPA-Puffer (Thermo Scientific) mit Protease-Inhibitor-Cocktail (cOmplete Tablets, Mini, EDTA-frei, Roche) und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (PhosSTOP EASY) extrahiert Pack, Roche) und die Proteinkonzentration wurden mit einem BCA-Assay-Kit (Thermo Scientific) gemessen. Das Immunblotting wurde mit Cx43 (1:500, polyklonales Serum, Sigma) durchgeführt und Gapdh (1:1000, AbCam) wurde als Normalisierungskontrolle verwendet. Unbeschnittene und unverarbeitete Scans von Western Blots sind in der ergänzenden Abbildung 6 enthalten.

Die primären BCECs und bEnd.3-Zellen wurden in konfluenten Monoschichten gezüchtet und die siRNA-Transfektionen wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. TransIT-TKO-Transfektionsreagenz (Mirus Bio.) wurde für die meisten Experimente (2 μl/Well einer 96-Well-Platte) zusammen mit 50 nM Endkonzentrationen an siRNA verwendet. Pro Vertiefung wurden 100–200 μl des gesamten Reaktionsvolumens verwendet und in einem Inkubator (befeuchtet, 5 % CO2, 95 % Luftatmosphäre) bei 37 °C inkubiert. Etwa 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen visuell auf Transfektionseffizienz überprüft (durch Vergleich von si-Lethal und si-NT) und weitere Experimente wurden durchgeführt. Mit Ausnahme der Kontroll-siRNAs verwendeten wir für jedes Gen zwei unabhängige siRNA-Sequenzen mit jeweils drei Replikaten. Die in dieser Studie verwendeten siRNAs sind in der Ergänzungstabelle 5 beschrieben.

WT- oder Efna2–/– (m)-Mäuse wurden mit einer Dosis von 105 PFU/Maus LACV (IP) geimpft. Bei 3 dpi wurden diesen Mäusen retroorbital (intravenös; IV) 100 nm große FluoSpheres-Carboxylat-modifizierte Mikrosphärenkügelchen (Thermo Scientific) injiziert. Die Mäuse wurden nach 30 Minuten eingeschläfert. Durch Anästhesie und anschließende transkardiale Perfusion. Die Gehirne der Mäuse wurden entnommen und auf ähnliche Weise für Kryoschnitte verarbeitet. Die Kryoschnitte wurden mit Hoechst gegengefärbt, nachdem die Objektträger mit PBS rehydriert wurden. Nach der Montage wurden ein Leica DMI 6000B Epifluoreszenzmikroskop und die LAS-X-Software zur Bildaufnahme verwendet.

4-PBA (Sigma) und rec-EFNA2 (Sino Biological) wurden zur Zellbehandlung in normalem Kulturmedium gelöst. Dimethylsulfoxid (DMSO; (< 0,5 %)) wurde verwendet, wenn Partikel in der höchsten Konzentration von 4-PBA (10 mM) beobachtet wurden. Gemäß den Empfehlungen aus einem früheren Bericht52 verwendeten wir eine Höchstdosis von 500 mg/kg-Tag und achteten darauf, einen durch Arzneimitteltoxizität verursachten Tiertod zu vermeiden. Den entwöhnten Mäusen (~10 g) wurde 4-PBA (500 mg/kg-Tag) injiziert, das in Maisöl (mit 200–300 μl DMSO/10 ml) gelöst war, und es wurden täglich ~200 μl IP-Injektion verabreicht. Die Mäuse wurden täglich gewogen und das Injektionsvolumen entsprechend angepasst. Vehikelmäusen wurde auf ähnliche Weise die mit DMSO ergänzte Maisöllösung in Abwesenheit von 4-PBA injiziert.

Die Efna2−/− (m) oder Efna2−/− (s) Mäuse wurden freundlicherweise von Prof. David Feldheim (University of California, Santa Cruz) gespendet. Die Mäuse wurden durch Inzucht gezüchtet und anhand der folgenden Methode auf ihre Genotypen überprüft: Ephrin A2-Primer sind A2-1: 5'-CCG CTT CCT CGT GCT TTA CGG TAT C −3', A2-2: 5'-GGG CCG GTT GCA TTC CCA GCG–3' und A2-3: 5'-GTG AGC GCT GTG GGT GAT GGC GGC–3', wobei WT durch A2-2 und A2-3 nachgewiesen wird: 200 bp und die Efna2-Mutante durch A2-1 und nachgewiesen wird A2-2: 500 bp. Ephrin A3-Primer sind A3-1: 5'-GGC TTT TTC TAC AAT CTT TTC TCA – 3', A3-2: 5'-TCA TGT AGG AGA TAC AGG GC – 3' und A3-3: 5'-ACC AAA GAA CGG AGC CGG TTG GCG – 3', wobei WT durch A3-1 und A3-2 erkannt wird: 500 bp und Efna3-Mutant ist A3-2 und A3-3: 200 bp. Ephrin A5-Primer sind A5-1: 5'-AGC CCA GAA AGC GAA GGA GCA AAG C –3', A5-2: 5'-ATT CCA GAG GGG TGA CTA CCA CAT T –3' und A5-3: 5' -TCC AGC TGT GCA GTT CTC CAA AAC A –3', wobei WT durch Wildtyp A5-2 und A5-3 nachgewiesen wird: 400 bp und Mutante durch A5-1 und A5-3 nachgewiesen wird: 500 bp. Alle diese Primerdetails wurden an Transnetyx weitergegeben, um einen automatisierten Genotypisierungstest für Efna2, Efna3 und Efna5 zu entwickeln, und daraus wurden die Genotypen ermittelt.

Immunfluoreszenzstudien wurden gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll durchgeführt17. Für die Standardimmunfluoreszenz wurden primäre BCECs oder bEnd.3-Zellen auf einer Multiwellplatte oder einem Kammerglasobjektträger ausplattiert. Die Proben wurden mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS fixiert, gefolgt von der Permeabilisierung der Zellen mit PBS, das 0,5 % Triton X-100 enthielt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS blockiert, das 5 % hitzeinaktiviertes Eselserum und 0,5 % Triton X-100 enthielt. Nach der Inkubation mit primären Antiseren (verdünnt in Blockierungslösung) für 1 Stunde (RT) oder über Nacht (4 °C) wurden unspezifisch gebundene Antikörper mit Blockierungsserum abgewaschen. Abschließend wurden die Proben mit in Blockierungslösung verdünnten sekundären Antiseren markiert, mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit Hoechst-Färbung inkubiert. Die Proben wurden mit Fluoromount-G (Southern Biotech) montiert und zur Aushärtung bei Raumtemperatur im Dunkeln getrocknet und für den Langzeitgebrauch bei 4 °C gelagert oder mit PBS in einem 4 °C-Kühlschrank gelagert. Die Bilder wurden mit einem CX7-Mikroskop (Thermo Scientific) oder einem Leica DMI8000 Inverted Confocal Microscope (Chicago, IL) aufgenommen. Die Bilder und Quantifizierungsdaten wurden mit Cellomics-Software (Cx7-Maschine), LAS ) oder FlowJo 10.8.1-Software. Es wurden Graph Pad Prism 8 und 9 und Microsoft Excel (2010) verwendet.

Mäuse wurden transkardial mit PBS perfundiert und Gehirne entnommen. Anschließend wurden die Gehirne 24 Stunden lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) fixiert, gefolgt von einer Äquilibrierung der Gehirne in 10 % Saccharose und dann 30 % Saccharose. Nach der Kryoprotektion wurden die Gehirne unter Verwendung der Tissue Plus OCT-Verbindung (Fisher HealthCare) montiert, eingefroren und 10-um-Schnitte wurden unter Verwendung eines CM1 950-Kryotoms (Leica Microsystems) erhalten. Die Schnitte wurden dann mit LACV-Antikörper (1:500–1:800) oder einem ZO1-Antikörper (1:250, Thermo Scientific) unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Methode41 mit geringfügigen Modifikationen gefärbt. Kurz gesagt, gefrorene Gewebeschnitte wurden mit eiskaltem 95 %igem Ethanol und anschließend PBS bei Raumtemperatur (RT) gewaschen, um die Kryomatrix zu entfernen. Um die Abschnitte abzugrenzen, wurde ein hydrophober Markierungsstift verwendet. Die Objektträger wurden dann mit PBS (dreimal) gewaschen und mit Blockierungsserum (PBS mit 0,5 % Triton X-100 und 5 % Eselserum) bei RT inkubiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C mit dem primären Antiserum, das in Blockierungsserum verdünnt war, inkubiert. Die Schnitte wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit sekundärem Antiserum, verdünnt in Blockierungsserum, 2 Stunden lang bei RT inkubiert. Alle Inkubationen wurden in einer befeuchteten Kammer durchgeführt. Schließlich wurden die Zellkerne nach dreimaligem Waschen mit PBS mit Hoechst gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem Leica DMI8000 Inverted Confocal Microscope (Chicago, IL) aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Software ImageJ (1.52a, NIH), Fiji (1.52n, NIH) oder Imaris 8 (Bitplane, Schweiz) verarbeitet.

Die Überstände der infizierten und scheininokulierten bEnd.3-Kulturen wurden an verschiedenen HPI gesammelt. Plaque-Assays wurden mit einer zuvor beschriebenen Methode17 durchgeführt. Kurz gesagt, die Vero-Zell-Monoschichten wurden mit unterschiedlichen Verdünnungen der Überstände in DMEM, ergänzt mit 2 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, beimpft. MEM mit 1,5 % Carboxymethylcellulose (CMC) wurde nach 1 Stunde zugegeben und bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 und 95 % Luft inkubiert. Bei 5 dpi wurden die Zellen mit 10 %iger Formalinlösung fixiert, gewaschen und die Plaques mit 0,35 %iger Kristallviolettlösung sichtbar gemacht.

Die bEnd.3-Zellen wurden bei spezifischem HPI entnommen und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des CellTiter-Glo-Reagenzes (Promega) unter Verwendung des Protokolls des Herstellers gemessen. Die Lumineszenz wurde mit FLUOstar Omega (BMG Labtech) gemessen. Alternativ wurde die Zellzahl anhand der Anzahl der Zellkerne (gefärbt von Hoechst) mit einem Cx7-Imager (Thermo Scientific) gemessen.

Die konfluenten Monoschichten von bEnd.3-Zellen wurden bei 4 °C vorgekühlt und die Zellen wurden mit 10 MOI LACV-Inokulum auf Eis infiziert. Die Zellen wurden 2–3 Stunden lang bei 4 °C gehalten, damit sich die Viruspartikel nur an der Zelloberfläche anheften, sich aber bei der reduzierten Temperatur nicht vermehren konnten. Das Inokulum wurde vorsichtig entfernt und die Zellen wurden gründlich (2–3 Mal) bei 4 °C gewaschen. Anschließend wurde frisches Kulturmedium hinzugefügt und die Zellen auf 37 °C gebracht. Anschließend ließ man das anhaftende Virus in den Zellen bei der erhöhten Temperatur bis zu 24 hpi amplifizieren und wurde mittels Immunfluoreszenzassay auf LACV-Intensität analysiert.

In jedem Experiment werden Mittelwerte ± Standardabweichung oder einzelne Datenpunkte mit Mittelwert angezeigt. Für RNA-seq-Analysen wurde ein negatives binomiales verallgemeinertes Modell mit Wald-Signifikanztest durchgeführt. Die zweiseitigen p-Werte wurden für Mehrfachtests mit der Benjamini-Hochberg-Methode korrigiert. Eine einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest oder Dunnetts Mehrfachvergleichstests, werden als Post-hoc-Analysen für Mehrfachmittelwertvergleiche oder Kontrollmittelwertvergleiche durchgeführt. Bei Zwei-Gruppen-Vergleichen oder Screening-Analysen werden mehrere gepaarte oder ungepaarte t-Tests durchgeführt. Überlebensvergleiche wurden mithilfe des Log-Rank-Tests (Mantel-Cox) durchgeführt. Die Einzelheiten der statistischen Auswertungen sind in den einzelnen Abbildungslegenden aufgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die RNA-seq-Daten wurden beim Gene Expression Omnibus (GEO) hinterlegt und sind öffentlich verfügbar (GSE217434). Hyperlink zum Datensatz: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=Gse217434. Die SIGNAL-Software ist über diesen Hyperlink für die Öffentlichkeit zugänglich: https://signal.niaid.nih.gov/. Die Wildtyp-Mäuse (RRID: IMSR JAX:000664 und Stamm-Nr.:000664) sind im Jackson Laboratory erhältlich. Die Efna2−/− Mäuse sind auf Anfrage im Labor von Dr. Iain Fraser, NIAID, erhältlich. Die anderen während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Prof. David Feldheim (University of California in Santa Cruz) für die freundliche Spende von Efna2−/− (m) und Efna2−/− (s) Mäusen. Wir danken Samuel Katz, Jing Sun und Sharat Vayttaden für ihre freundliche Unterstützung und Schulung für das Transkriptom-Screening, das siRNA-gezielte Screening bzw. die Hochdurchsatz-Bildgebung. Wir danken der Rocky Mountain Laboratories Genomics Unit der NIAID Research Technologies Branch für die freundliche Unterstützung bei RNA-Seq- und Folgeanalysen. Wir danken insbesondere Stacy Ricklef für die Vorbereitung der RNA-seq-Bibliothek und die Sequenzverarbeitung. Wir danken auch dem Imaging Core der NIAID Research Technologies Branch für die Bereitstellung von Bildgebungseinrichtungen. Wir würdigen und danken den NIAID 14BS-Tierpflegern und Facility Managern für ihre Unterstützung bei der Pflege und Zucht der Tiere. Wir danken außerdem James Striebel, Simote Foliaki, Sinu John, Clinton Bradfield und Julia Gross für die kritische Lektüre des Manuskripts sowie den Mitgliedern des Laboratory of Persistent Viral Diseases (LPVD), RML und des Laboratory of Immune System Biology (LISB), Bethesda für kritischen Input und Unterstützung im Verlauf dieser Arbeit. Diese Studie wurde vom Intramural Research Program des National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) und den National Institutes of Health (NIH) unterstützt. RB wurde vom RML-Bethesda NIAID Fellowship unterstützt.

Open-Access-Förderung durch die National Institutes of Health (NIH).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Karin E. Peterson, Iain DC Fraser.

Abteilung für Neuroimmunologie, Labor für persistierende Viruserkrankungen, Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH, 903 S. 4th Street, MT, 59840, Hamilton, USA

Rahul Basu, Clayton W. Winkler und Karin E. Peterson

Abteilung für Signalsysteme, Labor für Biologie des Immunsystems, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4 Memorial Drive, Bethesda, MD, 20892, USA

Rahul Basu und Iain DC Fraser

Forschungstechnologiezweig, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4 Memorial Drive, Bethesda, MD, 20892, USA

Sundar Ganesan

Abteilung für Genomikforschung, Forschungstechnologiezweig, Abteilung für intramurale Forschung, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 903 S. 4th Street, MT 59840, Hamilton, MT, USA

Sarah L. Anzick & Craig Martens

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RB führte die Experimente durch und schrieb das Manuskript. SG unterstützte bei der Erfassung, Verarbeitung und Analyse konfokaler Bilder. CW führte alle Experimente im Zusammenhang mit der RNA-seq-Analyse durch. SLA und CM führten die RNA-seq-Daten durch, analysierten und inventarisierten sie und halfen bei transkriptomischen Screening-Datenanalysen (IPA-Analyse, Vorbereitung von Vulkandiagrammen usw.). KEP und IDCF haben das Projekt entworfen, die Experimente überwacht und das Manuskript geschrieben. KEP und IDCF trugen gleichermaßen bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Karin E. Peterson oder Iain DC Fraser.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Alle Autoren haben der Einreichung dieses Manuskripts zugestimmt.

Nature Communications dankt Andrew MacLean und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Basu, R., Ganesan, S., Winkler, CW et al. Identifizierung altersspezifischer Genregulatoren der Neuroinvasion und Pathogenese des La-Crosse-Virus. Nat Commun 14, 2836 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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Eingegangen: 07. August 2022

Angenommen: 03. April 2023

Veröffentlicht: 18. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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