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May 24, 2023

Die Variation der chemischen Signale der Maus wird genetisch kontrolliert und durch die Umwelt moduliert

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8573 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei den meisten Säugetieren und insbesondere bei Mäusen beruht die chemische Kommunikation auf der Erkennung ethologisch relevanter Fitnesssignale anderer Individuen. Bei Mäusen ist Urin die Hauptquelle dieser Signale. Daher haben wir Proteomik und Metabolomik eingesetzt, um Schlüsselkomponenten der chemischen Signalübertragung zu identifizieren. Wir zeigen, dass bei der Darstellung des genetischen Hintergrunds, des Geschlechts und der Umwelt in zwei Hausmaus-Unterarten, Mus musculus musculus und M. m., ein Zusammenhang zwischen flüchtigen Urinbestandteilen und Proteinen besteht. Domesticus. Wir fanden heraus, dass die Umwelt einen starken Einfluss auf die Variation von Proteom und Metabolismus hat und dass flüchtige Gemische Männer besser repräsentieren, während Frauen überraschenderweise mehr geschlechtsspezifische Proteine ​​aufweisen. Mithilfe von maschinellem Lernen und kombinierten Omics-Techniken haben wir Mischungen aus Metaboliten und Proteinen identifiziert, die mit biologischen Merkmalen verbunden sind.

Alle lebenden Organismen sind ständig mit chemischen Signalen aus ihrer Umwelt und von anderen Individuen konfrontiert. Bei Mäusen wirken diese Signale häufig auf angeborene1 oder erlernte2 Repräsentationen im Gehirn und führen zu Verhaltensreaktionen, die das Überleben und die Fitness fördern. Beispielsweise wird eine männliche Maus wahrscheinlich Signale erzeugen, um ihre Fitness anzukündigen, was bei anderen Männchen zu Vermeidungsverhalten und bei Weibchen zu sexueller Anziehung führen würde3,4,5. Einige dieser Signale sind artspezifisch oder subspezifisch und werden zur Peer-Erkennung verwendet6,7. Darüber hinaus folgt jede Person, unabhängig vom Geschlecht, einem Hinweis, der auf ein Lieblingsessen hinweist, oder meidet einen Hinweis, der auf Raubtiere hinweist8. Die meisten Verhaltensstudien konzentrieren sich auf die Wirkung einzelner oder weniger Verbindungen und Proteine ​​als Signalmoleküle. Tiere und ihre Umgebung sind jedoch komplexer und anstelle einzelner oder mehrerer untersuchter Verbindungen produzieren die meisten Organismen, einschließlich Bakterien9 und Pflanzen10, n-dimensionale Anordnungen von Verbindungen. Es ist oft die Zusammensetzung dieser Blumensträuße, die bei den Empfängern Verhalten und physiologische Reaktionen hervorruft11. Um dieses Rätsel noch komplexer zu machen, kann die Reaktion auf denselben Hinweis je nach Umgebungsfaktoren variieren. Daher haben wir gefragt, ob biologische Merkmale wie Geschlecht und genetischer Hintergrund eines Individuums durch Proteome oder Metabolome manifestiert werden und inwieweit diese beiden Gruppen miteinander verbunden oder sogar korreliert sind. Dies ist wichtig, da sexuelle Signale bekanntermaßen sexuell dimorphe Schaltkreise und auffällige sexuell dimorphe Sinnesrepräsentationen im akzessorischen Riechkolben12 und der medialen Amygdala13 auslösen. Es fehlt jedoch ein umfassender Überblick über chemische Signale, die diese Repräsentationen auslösen können. Generell interessierte uns, wie Sexualität in einem Organismus zum Ausdruck kommt, für den die fitnessbezogenen olfaktorischen Hinweise wichtiger sind als die visuellen.

Mäuseurin enthält große Mengen und eine Vielzahl von Molekülen, die als Geruchssignale dienen. Sie sind durch chemosensorische Rezeptoren der großen Riechepithelien und/oder des vomeronasalen Organs (VNO) nachweisbar14,15,16,17,18,19,20,21,22. Diese Signale führen zu vielfältigen physiologischen Reaktionen im Empfänger13,23,24,25,26,27,28,29,30,31, auch wenn sie durch ausgewählte nichtflüchtige Haupturinproteine ​​(MUPs)32,33 und kurze Peptide34,35 stimuliert werden. und/oder flüchtige organische Verbindungen (VOCs)36,37,38. Bei Mäusen galten VOCs als starke Signale, die von Riechgeweben erkannt werden konnten18,39, während MUPs meist als Transporter dieser Signale in ihren achtsträngigen Betafässern37,40,41,42,43,44,45,46,47 und angesehen wurden prägen so die individuellen Geruchssignaturen48. Verschiedene Autoren haben jedoch gezeigt, dass bestimmte MUPs ein eigenständiges Signal darstellen, das von VNO32,49,50,51 erkannt werden kann, und dass einige dieser Moleküle, darunter das männlich beeinflusste MUP20 (bekannt als Darcin), komplexe angeborene Verhaltensweisen hervorrufen, darunter Aggression33, Partnererkennung52 und Lernen32 . Da sich jedoch fast alle bisherigen Studien nur auf MUPs konzentrierten, gibt es noch keine Studie, die das gesamte Spektrum der Urinproteine ​​und flüchtigen Stoffe zeigt, die möglicherweise auch an der chemischen Kommunikation beteiligt sind, insbesondere bei wild lebenden Nagetieren.

Aufgrund ihrer Bedeutung für die männliche Sexualsignalisierung sind MUPs im Urin von Mäusen sehr häufig anzutreffen und wirken sich auf Männer aus53,54,55, wo sie kleine flüchtige Verbindungen in ihrem achtsträngigen Beta-Fass schützen und transportieren40,56 und auch deren Freisetzung verzögern57. Interessanterweise sind MUP-Muster und der Grad des sexuellen Dimorphismus unterartspezifisch7,58,59, was MUPs auch als Kandidatenmoleküle für die Erkennung von Unterarten wichtig macht60,61,62. Obwohl Frauen weniger MUPs haben als Männer, sind diese Proteine ​​auch an der Signalisierung des weiblichen Sexualstatus beteiligt, da sich ihre Konzentration im Urin29 und Vaginalsekret63 während des Brunstzyklus ändert und während der Brunst ihr Maximum erreicht. Ebenso beeinflusst der soziale Status die Produktion von MUPs. Dies wurde bei wild vorkommenden M. m. nachgewiesen. Musculus-Mäuse unter Laborbedingungen28 und in naturnahen Gehegen, wo Männchen nach der Eroberung eines Territoriums die Ausscheidung von MUPs verdoppelten und sozial dominant wurden64. Die MUP-Menge macht bis zu 85 % (oder sogar mehr) aller Proteine ​​im Urin aus65, und daher haben diese Proteine ​​möglicherweise die Aufmerksamkeit von mehreren hundert anderen wichtigen Proteinen abgelenkt, die an verschiedenen homöostatischen, metabolischen und Signalfunktionen beteiligt sind.

Um herauszufinden, ob es subspezifische und geschlechtsspezifische Unterschiede bei der Hausmaus gibt, haben wir Urinproben von mehreren wildstämmigen Stämmen gesammelt, die zwei Unterarten repräsentieren, M. m. Musculus (MUS, 7 Stämme) und M. m. Domesticus (DOM, 9 Stämme). Wichtig ist, dass beide Stammgruppen in derselben Zuchtanlage gehalten wurden. Unser Ziel war es, Hauptkomponenten der chemischen Signalübertragung auf zwei Auflösungsebenen zu erkennen – metabolomisch und proteomisch. So erzeugten wir flüchtige Metabolome mit zweidimensionaler umfassender Head-Space-Gaschromatographie und Massenspektrometrie und Aliquots derselben Proben wurden parallel für die Analyse von Proteomen mit nLC-MS/MS verwendet. Subspezifische und geschlechtsspezifische Unterschiede dienten als Indikator für evolutionäre Veränderungen aufgrund natürlicher oder sexueller Selektion. Die resultierenden Profile können jedoch auch durch die natürliche Umgebung beeinflusst werden, daher haben wir zusätzliche Proben von wild gefangenen M. m. untersucht. Musculus (wMUS) Mäuse. Zusammenfassend analysierten wir vollständige Proteome und Metabolome der drei Mausgruppen jedes Geschlechts, um neue Einblicke in die chemische Signalübertragung der Maus zu gewinnen.

Der proteomische Datensatz enthält insgesamt 958 Proteinidentifikationen, die aus 10 μl Urin jeder Probe generiert wurden, und die resultierende Expressionsmatrix wurde LFQ-normalisiert (markierungsfreie Quantifizierung66). Die gleiche Menge Urin (10 μl) wurde zur Extraktion flüchtiger Stoffe verwendet und die resultierende Datentabelle enthielt insgesamt 2701 Identifizierungen basierend auf eindeutigen Massen und Retentionszeiten. Zuerst haben wir unsere Datensätze für Singletons und Doubletons reduziert, sodass nur die Moleküle, die von mindestens drei Individuen derselben Gruppe (z. B. DOM-Männchen) produziert wurden, für weitere Analysen weitergegeben wurden. Der endgültige proteomische Datensatz enthält somit 416 Proteinidentifikationen. Wir haben die gleiche Filterung für flüchtige Stoffe durchgeführt, allerdings reagieren flüchtige Metabolome empfindlich auf falsch positive Ergebnisse, da dieselben Moleküle natürlicherweise in Tieren, aber auch in der Luft vorkommen können. Um den Effekt falsch positiver Ergebnisse zu verringern, haben wir alle Moleküle (dh Reihen) entfernt, die nur in Blindproben (dh Luftproben aus den Labors, in denen die Proben verarbeitet wurden) vorhanden waren. Im verbleibenden Satz haben wir eine bimodale Verteilung entdeckt, die aus der Mischung zweier Normalverteilungen resultiert. Für die Überlappung dieser Verteilungen (siehe Methoden) haben wir den hinteren p-Wert aus normalgemischten Modellen berechnet und wenn der p-Wert der Zugehörigkeit zu Blindproben und Proben p < 0,05 war (d. h. entsprechende FD < 7,1), wurden die angegebenen Zeilen entfernt. Dieser Vorgang entspricht der Identitätswahrscheinlichkeit IL < 0,9 (siehe Methoden). IL ist ein nützliches Werkzeug, um zu visualisieren, ob bestimmte flüchtige Stoffe wahrscheinlich für die untersuchten Gruppen charakteristisch sind. Dieser Datensatz enthielt schließlich insgesamt 875 Moleküle und der gesamte Satz wurde quantilnormalisiert. Mehr als 54 % der Metabolomkomponenten in dieser Studie sind strukturell verwandte aliphatische Aldehyde und Alkohole. Die Länge des Kohlenstoffrückgrats dieser Moleküle beträgt typischerweise C6–C8. Das am häufigsten vorkommende Molekül ist 2-Hexenal (33,8 %). 2-Hexenal ist Teil des sogenannten „grünen Geruchs“ (GO), einer Mischung aus acht aliphatischen C6-Aldehyden und C6-Alkoholen, die für den Geruch junger Blätter oder frisch geschnittenen Grases verantwortlich sind1. Mehrere Studien zeigen eine hohe Geruchsempfindlichkeit einiger Säugetiere gegenüber GO2, einschließlich Menschen3, und weisen auf antidepressive4 und anxiolytische2 Wirkungen bei Mäusen hin.

Um potenzielle Variationsquellen in unseren Daten zu untersuchen, haben wir die Sparse Partial Least Squares Discriminant Analysis (sPLS-DA) verwendet, da sie in großen Datensätzen zufriedenstellende Vorhersageleistungen bietet. In allen drei Vergleichen in Abb. 1A – C war das Geschlecht der stärkste Faktor, der die Metabolom- und Proteomtrennung innerhalb der drei Mausgruppen beeinflusste. Wir zeigen in Abb. 1A, dass die Metabolome von MUS und DOM jedes Geschlechts voneinander getrennt sind. Da die MUS- und DOM-Mäuse über Generationen hinweg unter den gleichen Bedingungen gehalten wurden, ist diese klare Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Metabolomen höchstwahrscheinlich auf die genetische Divergenz zwischen diesen beiden Unterarten zurückzuführen. Es gibt jedoch auch getrennte wMUS jedes Geschlechts sowohl von den im Labor gezüchteten MUS- als auch von den DOM-Gruppen. Dies zeigt, dass sich das Urinmetabolom der Maus nach Unterart, Geschlecht und Umgebung unterscheidet. Daher gehen wir davon aus, dass jede Komponente der äußeren Umgebung wie Nahrung, Mikrobiota67, Pflanzen und natürlich vorkommende Luftmoleküle direkten Einfluss auf die Stoffwechselprofile und die Metabolitenverarbeitung eines Individuums haben kann. Proteomische Daten in Abb. 1B zeigen, dass das Geschlecht wiederum der Hauptfaktor für die Trennung ist (31 % der erklärten Variation, x-Variable 1). Aufgrund der genomischen Unterschiede ist die Unterscheidung zwischen MUS-Männchen und DOM-Männchen eindeutig, und dies gilt auch für Frauen. Allerdings sind, ähnlich wie in den Metabolomen, wMUS-Männchen (wMUS.male vs. Other(s), Comp 2 (y-Achse): Area Under Curve – AUC = 0,9761, p = 2,798e-06) und wMUS-Weibchen (wMUS.female vs Andere(r) AUC = 0,9543, p = 7,779e-06) sind wiederum von allen anderen Gruppen getrennt (d. h. nahezu perfekte Diskriminierung), obwohl in diesem Szenario wMUS und MUS näher beieinander liegen als bei DOM. Dies ist ein begründeter Beweis dafür, dass alle drei Faktoren (Geschlecht, Gruppe und Umwelt) einen Einfluss auf die Differenzierung haben, obwohl die Umwelt einen geringeren Einfluss hat als auf Metabolome. Als nächstes extrahierten wir aus dem gesamten Datensatz nur Lipocaline mit achtsträngigen Betafässern und Calycine mit zehnsträngigen Betafässern für ihre bekannten Transportfunktionen in der chemischen Kommunikation, überprüft in68. Hier (Abb. 1C) überlappen sich MUS- und wMUS-Männchen, ebenso wie MUS- und wMUS-Weibchen. Allerdings sind DOM-Weibchen weniger von DOM-Männchen getrennt und erreichen die niedrigsten AUC-Werte (DOM.female vs. Other(s), Comp 1 (x-Achse) – AUC = 0,5630, p = 5,350e-01), aber es geht ihnen gut getrennt von wMUS und MUS. Dieser Beweis bestätigt auch unsere zuvor gemeldete Feststellung, dass der Grad des sexuellen Dimorphismus bei der Expression von MUPs bei MUS höher ist als bei DOM7. Die wichtigste Schlussfolgerung hier ist, dass die Variation von Lipocalin und Calycin durch genetische Unterschiede (DOM vs. MUS) und nicht durch die Umwelt (MUS vs. wMUS) gesteuert wird, während ganze Proteome und Metabolome umweltbedingt moduliert werden.

Proteome und Metabolome stehen unter genomischer und umweltbedingter Kontrolle. Die Diskriminanzanalyse sPLS-DA zeigte einen starken Einfluss der Umgebung auf Metabolome (A) und Proteome (B), da die wMUS wilder Mäuse klar von den im Labor gezüchteten MUS- und DOM-Gruppen getrennt sind. Lipocaline (C) stehen jedoch unter genomischer Kontrolle, was dadurch gezeigt wird, dass DOM-Männchen und -Weibchen von überlappenden MUS und wMUS innerhalb jedes Geschlechts getrennt werden. Die Hintergrundvorhersage (Polygone) basiert auf der Methode der maximalen Entfernung. Um herauszufinden, welche Proteine ​​und flüchtigen Stoffe jedes Geschlecht am besten repräsentieren (D), zeigen wir mit einem Zufallswald zur Klassifizierung die dreißig wichtigsten geschlechtsbestimmenden Moleküle, die nach ihrer Wichtigkeit basierend auf permutierten Out-of-Bag-Scores (OOB) (D–) geordnet sind. ICH). Die beiden wichtigsten Beispiele für wichtige flüchtige Stoffe und in jedem Stamm sind in (J–O). Chemische Strukturen können kostenlos von https://www.chemspider.com heruntergeladen werden. Farbcode: Dunklere Farben sind Männchen, hellere Farben sind durchgehend Weibchen.

Um herauszufinden, welche dieser Proteine ​​und flüchtigen Stoffe die Unterschiede aufgrund des Geschlechts am besten vorhersagen, haben wir zur Klassifizierung einen Zufallswald verwendet (Abb. 1D-I). In Abb. 1J-O zeigen wir Beispiele der wichtigsten Verbindungen, die das Geschlecht am besten trennen und die mit Random Forest nachgewiesen wurden. Bei der Betrachtung von Proteinen stellt MUP20 (bekannt als Darcin) das Geschlecht in MUS (9. Position) und DOM (2. Position) gut dar, nicht jedoch in wMUS. An zweiter Stelle steht beispielsweise das weiblich beeinflusste Protein C3 (Power Law Global Error Model – PLGEM, FDF-M = 20,6, PwMUS = 0,02), das eine zentrale Rolle bei der angeborenen Immunität spielt, und ENO1 an vierter Stelle (FDF-M =). 5,9, PwMUS = 0,003) stimuliert die Immunglobulinproduktion (aus UNIPROT-Funktionen entnommen, https://www.uniprot.org/). Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass wMUS direkte Nachkommen wild gefangener Mäuse sind, während MUS und DOM über Generationen hinweg in derselben Einrichtung gezüchtet und gehalten wurden. Die wilde Umgebung ist immunologisch anspruchsvoller als die Standardbedingungen der Mausanlage, und daher haben wilde Mütter vermutlich ihre Mikrobiota und ein „Immungedächtnis“ auf ihre Nachkommen übertragen, das von der Mikrobiota des Wirts beeinflusst wird67,69. Dies wird auch durch die stark angereicherten und signifikanten GO-Terme (FDR < 0,01) in wMUS (im Gegensatz zu MUS und DOM) bestätigt, das vom Prozess des Immunsystems dominiert wird (Proteine: CD48, C3, CD59A, CD44, SDC4, LCN2, DPP4). , EZR). Darüber hinaus wurden Unterschiede in der Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften zwischen im Labor gezüchteten DOM- und MUS-Mäusen und Wildmäusen zuvor in derselben Einrichtung mit ähnlichen Mäusen und ähnlichem Design untersucht70. Sie fanden heraus, dass Labor-DOM und MUS ähnliche Mikrobiota aufweisen und dass sich beide von wMUS und wDOM unterscheiden. Ihre Ergebnisse legen nahe, dass divergierende mikrobielle Gemeinschaften zur proteomischen und metabolomischen Variation beitragen können.

Bei Mäusen hängt die Partnerwahl nicht nur von den Weibchen ab, sondern beide Geschlechter sind bis zu einem gewissen Grad „wählerisch“71,72. Deshalb stellten wir eine wichtige Frage: Wie viele Proteine ​​und flüchtige Stoffe sind sexuell dimorph und nutzen beide Unterarten das gleiche chemische System? signalisieren? Um die Hypothese zu testen, dass Männchen und Weibchen unterschiedliche chemische Urinprofile haben und dass die beiden Unterarten möglicherweise unterschiedliche Signalsysteme entwickelt haben, verwendeten wir PLGEM-Modelle der differentiellen Expression, um das Ausmaß sexueller Dimorphismen zu extrahieren, und in Kombination mit Deep Learning wollten wir diese identifizieren wichtigsten (repräsentativen) Moleküle in den Wolken signifikanter geschlechtsspezifischer Daten für jede der drei Mausgruppen. In Abb. 2A-F zeigen wir MA-Diagramme, in denen flüchtige Stoffe (A–C) und Proteine ​​(D–F) als Faltdifferenzen (FD) gegen die mittleren Signalintensitäten und im log2-Maßstab aufgetragen sind, Abb. 2A-F. Wichtige Proteine ​​und flüchtige Stoffe, die mit Random Forest identifiziert wurden, und solche, die zu den ~25 wichtigsten Molekülen gehören (Wichtigkeit > 0,1), werden mit Gen- oder Verbindungsnamen gekennzeichnet. Die beruhigende Botschaft hier ist, dass die meisten der Top-Moleküle, die mit Deep Learning identifiziert wurden, mithilfe der Analyse der differentiellen Expression bestätigt wurden (z. B. MUP20 in DOM und MUS, MUP21 in wMUS).

Sexuell dimorphe Moleküle bewahren den geschlechts- und sortenspezifischen Geruchsraum. Unterschiedlich häufig vorkommende flüchtige Stoffe (A–C) und Proteine ​​(D–F, p < 0,05, abs(FD > 2)) werden von grün nach blau skaliert, aber nur die zehn wichtigsten Proteine ​​und flüchtigen Stoffe, die mit „Random Forest“ als wichtig identifiziert wurden, sind mit gekennzeichnet Gennamen oder Verbindungsnummern. Oberhalb von y = 0 befinden sich die Moleküle mit weiblicher Voreingenommenheit, während die Moleküle mit männlicher Voreingenommenheit unterhalb der roten Linie (y = 0) liegen. Der nächste Vergleich umfasste signifikante geschlechtsspezifische flüchtige Stoffe und Proteine ​​mit p < 0,05 und abs(FD) > 2. In allen drei Vergleichen (G–I) hatten Männer mehr geschlechtsspezifische flüchtige Stoffe, während Frauen mehr geschlechtsspezifische Proteine ​​hatten. Obwohl dieses Muster in allen drei Gruppen signifikant ist, offenbart jede Gruppe Sexualität durch unterschiedliche flüchtige Stoffe und Proteine ​​(Schnittdiagramme in J–K). Abkürzungen: abs() bedeutet einen absoluten Wert von; FD steht für Fold Difference.

Das interessanteste Ergebnis, über das wir hier berichten, ist, dass Männchen eine größere Vielfalt an flüchtigen Stoffen produzieren, während Weibchen eine größere Vielfalt an Proteinen produzieren, während das Gesamtproteinvolumen bei Männchen wesentlich erhöht ist. Es ist unwahrscheinlich, dass diese Divergenz, die in allen drei untersuchten Mausgruppen konsistent ist, zufällig entstanden ist (Fishers exakter Zähltest: PDOM = 2.248e-11, PMUS < 2.2e-16, PwMUS < 2.2e-16), Abb . 2G–I. In Abb. 2J–K zeigen wir anhand der Schnittpunktdiagramme, dass sich die Geschlechtsidentität in jeder Mausgruppe durch unterschiedliche Moleküle manifestiert oder dass diejenigen, die von allen Männchen (34 flüchtige Stoffe, 3 Proteine) oder von allen Weibchen (13 flüchtige Stoffe, 18) geteilt werden, vorhanden sind Proteine) sind seltener. Dies bedeutet, dass männliche und weibliche Geruchsräume von Molekülen dominiert werden, die eine stammabhängige Ausprägung aufweisen, während solche, die unabhängig von der Herkunft der Maus stereotyp bei Männern oder Frauen erzeugt werden, weniger häufig sind. Ein Paradebeispiel für ein solches gemeinsames Molekül ist MUP20, das in allen drei untersuchten Mausgruppen deutlich männlich beeinflusst ist. Darüber hinaus wird MUP20 nicht nur von Männern exprimiert, sondern ist in allen drei untersuchten Mausgruppen männlich. Dies bedeutet, dass zuvor berichtete pheromonale Aktivitäten von Darcin eher durch Expressionsunterschiede als durch geschlechtsspezifische (einzigartige) Expressionen gesteuert werden.

Um zu entwirren, wie Proteome und Metabolome interagieren, verwendeten wir die Diskriminanzanalyse für Blöcke (dh Block von Proteomen und Block von flüchtigen Stoffen). Zunächst fragten wir, ob Männer und Frauen aus allen drei Gruppen gemeinsame und beobachtbare Merkmale aufweisen, die Männlichkeit und Weiblichkeit definieren. In Abb. 3A sehen wir deutlich die für Frauen typischen Proteinblöcke, während Blöcke, die von flüchtigen Stoffen dominiert werden, Männer besser repräsentieren. Wir haben die Fläche unter der Kurve (AUC) verwendet, um den Nachweis zu erbringen, dass die Unterscheidung in beiden Dimensionen (AUC1 vs. AUC2) bei Proteinen perfekt und bei flüchtigen Stoffen sogar noch besser ist (Proteine: AUC1 = 0,9413, p = 1,429e-08, AUC2 = 0,9452, p = 1,071e-08; flüchtige Stoffe: AUC1 = 0,9796, p = 7,208e-10, AUC2 = 0,9821, p = 5,857e-10). Ein globaler Überblick über die Korrelationsstruktur auf Komponentenebene in Abb. 3B ergab eine starke Korrelation zwischen proteomischen und metabolomischen Daten (r = 0,92), was die Interpretation ermöglicht, dass beide Arten von Molekülen Sexualität in Kombination darstellen. Abbildung 3C zeigt, dass die Verteilung der Korrelationskoeffizienten (r > 0,65) nicht zufällig ist und dass – basierend auf den kreisförmigen Histogrammen – die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​positiv mit den am häufigsten vorkommenden flüchtigen Stoffen korrelieren. Daher haben wir in Abb. 3D ein Netzwerk extrahiert, das die besten Korrelationen (r > 0,62) zwischen Proteinen und flüchtigen Stoffen darstellt.

Die Integration von Proteomen und Metabolomen mit Korrelationsanalysen ergab neue potenzielle Wechselwirkungen. Die Clustered Image Map (A) zeigt, dass korrelierte Proteine ​​und Metaboliten die Geschlechtsunterschiede bei allen Individuen unabhängig vom Stamm am besten erklären. Männer haben mehr korrelierte flüchtige Stoffe, während Frauen mehr korrelierte Proteine ​​haben. Es besteht eine positive Korrelation zwischen Proteinen und flüchtigen Stoffen auf Komponentenebene (Korrelation = 0,92, p < 0,05) (B). Diese molekulare Multi-Omics-Signatur wird hauptsächlich durch die Korrelationen zwischen häufig vorkommenden Proteinen und flüchtigen Stoffen (C) verursacht, siehe die kreisförmigen Histogramme. Eine stringente Netzwerkanalyse (Korrelation > 0,6) zeigt mögliche Wechselwirkungen zwischen Proteinen und flüchtigen Stoffen (D) sowie zwischen (nur) Lipocalinen und flüchtigen StoffenI).

Die höchste Konnektivität eines flüchtigen Stoffs mit Proteinen, die durch Random Forest (Abb. 1D, F) als wichtig identifiziert wurde, ist typisch für (A1677), bei dem es sich um 2(5H)-Furanon, 5,5-Dimethyl- (d. h. 5) handelt ,5-Dimethylfuran-2(5H)-on). Es gehört zu den organischen Verbindungen, die als Butenolide bekannt sind. In unserem Netzwerk korreliert diese geschlechtsneutrale Verbindung mit den weiblich beeinflussten LCN2 und LCN11 und mit den männlich beeinflussten MUP1 und MUP10. Dieser Zusammenhang ist interessant, da 2(5H)-Furanon ein Quorum-Sensing-Molekül ist, das von Pilzen und Bakterien produziert wird, um das Bakterienwachstum zu regulieren. Beispielsweise fangen Rinder-OBPs diese Verbindung ab, um das Bakterienwachstum zu verhindern und so zu Krankheitserregern zu werden73. Gleichzeitig verhindert LCN2 das Bakterienwachstum, indem es eisenchelatbildende bakterielle Siderophore bei Mäusen und Menschen abfängt74. Ein weiteres wichtiges Molekül (DOM in Abb. 1d, MUS in Abb. 1e) ist A2124, bei dem es sich um (1,2,3,5,8,8a)-Hexahydronaphthalin, auch bekannt als Dysoxylonen, handelt, ein sehr hydrophobes Molekül, das dazu gehört zu Sesquiterpenoiden und im Urin benötigt wahrscheinlich einen Proteintransporter, um in die wässrige Umgebung zu gelangen. In unserem Netzwerk korreliert diese Verbindung auch mit dem auf Frauen ausgerichteten Protein LCN2, es kommt häufig bei Frauen von DOM, wMUS und MUS vor. Diese Analyse ergab auch hohe Korrelationen zwischen MUP20 und A919, bei dem es sich um 2-Acetyl-3-thiazolin handelt. Diese Verbindung ist 2-s-Butylthiazol, einem natürlichen Liganden von Darcin, sehr ähnlich. Allerdings zeigt 2-Acetyl-3-thiazolin in unseren Daten die Männlichkeit besser auf als 2-s-Butylthiazol, da es bei DOM- und MUS-Männern einzigartig ist (ca. 20-facher Unterschied, p < 0,0001) und bei wMUS deutlich männlich voreingenommen ist (ca. achtfach). Differenz, p < 0,0001). Darüber hinaus sind die Strukturen von 2-Acetyl-3-thiazolin und 2-s-Butylthiazol so ähnlich, dass sie möglicherweise den gleichen Transporter Darcin (MUP20) haben. Um einen weiteren Einblick in mögliche Beziehungen zwischen flüchtigen Stoffen und Proteinen zu erhalten, führten wir sPLS-DA an Blöcken eines vollständigen Satzes flüchtiger Stoffe und Lipocalinen ohne andere Proteine ​​durch. Die oben beschriebenen Beziehungen werden in Abb. 3E erneut bestätigt, wir haben jedoch auch einige neue und interessante Zusammenhänge gefunden. Das beste Beispiel ist MUP8, das mit A784 korreliert, bei dem es sich um 2-Methyl-1-nonen-3-in handelt. Diese Verbindung ist pflanzlichen/lebensmitteltechnischen Ursprungs und weist eine hohe antimikrobielle Aktivität75 auf. Es ist bei DOM-Männern erhöht und bei DOM-Frauen etwas geringer (FD = 2, P = 0,08, also NS), wohingegen nur wenige MUS- und wMUS-Individuen diese Verbindung aufwiesen. Die Korrelation zwischen MUP8 und Methyl-1-nonen-3-in über alle Individuen und Mausgruppen hinweg (r = 0,62) ist signifikant (P < 0,05). Obwohl dieser Ansatz zu interessanten Wechselwirkungen zwischen Proteinen und ihren potenziellen Liganden führt, ist die Durchführung weiterer Bindungsexperimente erforderlich, die jedoch den Rahmen dieser Studie sprengen.

In diesem Vergleich führten wir einen Random Forest für eine Untergruppe von Proteinen aus der Lipocalin-Familie durch. Zuerst haben wir die Bedeutung einzelner Proteine ​​für die Geschlechtertrennung in wMUS im Vergleich zu MUS im Random Forest (RF) außerhalb des Beutels aufgezeichnet (Abb. 4A) und festgestellt, dass die Spearman-Rangkorrelation hoch (rho = 0,86) und signifikant (p = 3e-) ist. 10; R2 = 0,51). Dies liegt daran, dass sie sich genetisch ähnlicher sind und somit die gleichen Proteine ​​charakteristisch für die Geschlechtertrennung sind. In ähnlicher Weise haben wir die RF-Bedeutung in DOM vs. MUS aufgetragen (Abb. 4B). Wie erwartet war die Korrelation zwischen DOM und MUS aufgrund der genetischen Unähnlichkeit zwischen den beiden Unterarten geringer (rho = 0,64; p = 0,0001; R2 = 0,25) als zwischen MUS und wMUS. Die Auftragung der RF-Bedeutung für die Geschlechtertrennung gegen die RF-Bedeutung für die subspezifische Trennung (MUS, DOM) ergab eine sehr geringe Korrelation (rho = 0,59; p = 0,0005; R2 = 0,001), Abb. 4C. Dieses divergierende Muster liefert Beweise für die spezialisierte Natur von Lipocalinen, wobei beispielsweise MUP20 und MUP21 die Geschlechtsidentität in allen untersuchten Gruppen offenbaren, während die Häufigkeit von MUP14 und MUP8 einen subspezifischen Status aufweist (siehe auch Abb. 4D-E). Insgesamt ist MUP20 (Darcin) auch der Haupttreiber des Sexualdimorphismus in unseren vollständigen proteomischen Datensätzen. In Heatmaps (Abb. 4D-E) werden nur MUS und DOM verglichen, da sie in derselben Anlage gezüchtet wurden. Hier zeigen wir anhand der sPLS-DA-Scores, dass mehr Lipocaline im Urin vorhanden sind als bisher berichtet und dass ihre Variation groß ist. Die hierarchische Clusterbildung bestätigte, dass das Geschlecht ein guter, wenn auch kein absoluter Prädiktor für die Lipocalin-Variation ist.

Kombinatorischer Lipocalin-Code. Random Forest (RF)-Diagramme der Bedeutung bestimmter Proteine ​​für die Geschlechtertrennung: (A) wMUS gegen MUS; (B) DOM gegen MUS; In (C) ist die RF-Bedeutung für die Geschlechtertrennung gegen die Unterartentrennung aufgetragen. Einzelne Punkte werden von blau (männlich) bis rot (weiblich) skaliert. (D–E) Die hierarchische Clusterbildung offenbart die kombinatorische Natur der Lipocalin-Häufigkeiten. In Heatmaps demonstrieren wir den relativen Beitrag von Proteinen zur Geschlechtertrennung mithilfe von sPLS-DA (x-Achse – Einzelnamen, y-Achse – Lipocalin-Gennamen).

Was ist das auffälligste Merkmal der chemischen Signale von Mäusen im Urin? Sind es die flüchtigen Stoffe oder Proteine? Im Gegensatz zu anderen Studien verwendeten wir für unsere markierungsfreie Massenspektrometrie größere Urinmengen (10 μl) direkt aus den Proben und verzichteten auf die Verwendung von IPG-Streifen und -Gelen. Viele gelbasierte MUP-Studien verwendeten die isoelektrische Fokussierung von Proteinen auf IPG-Streifen oder -Gelen mit einem isoelektrischen Punktebereich von pI 3,9–5,1, der nur MUPs und nicht die meisten anderen Lipocaline mit höherem pI wie OBPs und LCNs erfasst, die bei Frauen stärker erhöht sind. Dieser Ansatz führte oft dazu, dass man sich auf männliche MUPs als Haupttreiber sexueller Dimorphismen konzentrierte. Allerdings sind sie im Gegensatz zu Hunderten anderen Proteinen, die im Urin von Frauen vorkommen, überrepräsentiert. Wir verwendeten die beiden Hausmaus-Unterarten DOM und MUS, die in Europa eine schmale Hybridzone bilden, die von Norwegen bis zum Schwarzen Meer reicht76,77. Wir verwendeten Geschlechtsunterschiede bei der Produktion von Verbindungen als Indikator für die sexuelle Selektion, während Unterartenunterschiede als Indikator für die Artbildung dienten. Wir hatten noch eine weitere Gruppe von wMUS-Tieren, die dazu dienten, herauszufinden, ob die Kombination aus Umgebung und Hygienestatus (wild oder im Labor gezüchtet) die Harnprofile beeinflusst.

Zum ersten Mal zeigen wir, dass weibliche Mäuse eine Vielzahl weiblicher Lipocaline in ihrem Urin haben und dass einige dieser Lipocaline bisher nur in Schleimhautsekreten von Augen78, Nase79,80,81,82, Mundhöhle83 und Vagina63 nachgewiesen wurden ,84. MUPs werden in der Leber stark exprimiert85 und es wurde wiederholt nachgewiesen, dass sie mit dem Urin ausgeschieden und als Urinflecken abgelagert werden, wodurch ihre Liganden (VOCs) langsam freigesetzt werden. Maus-OBPs werden nicht in der Leber exprimiert86, sind jedoch in der Vagina reichlich vorhanden, wo sie zusammen mit anderen nachgewiesenen Proteinen exprimiert werden, einschließlich LCN11, LCN2, MUP9, Darcin und anderen Lipocalin-Mitgliedern. Sie werden während des Östrus und des Metöstrus hochreguliert und sinken im Proöstrus auf niedrigere Werte63. Daher ist es wahrscheinlich, dass weibliche Drüsen und Fortpflanzungsorgane einige der in ihrem Urin nachgewiesenen Proteine ​​produzieren, was ihren Fortpflanzungszustand widerspiegelt. Dies bestätigt unsere früheren Studien, die zeigten, dass die Häufigkeit weiblicher MUPs im Urin mit dem Östruszyklus bei Labormäusen29 und wMUS28 Mäusen korreliert, die in 68 besprochen wurden.

Aus einer breiteren Sicht haben wir eine grundlegende Frage der Biologie angesprochen, nämlich wie Sexualität bei Tieren signalisiert wird87, die in erster Linie von olfaktorischen Hinweisen abhängt88,89 und ob ein einzelnes Pheromon oder eine Mischung von Verbindungen möglicherweise dazu dienen kann, das soziale und reproduktive Verhalten des Empfängers zu beeinflussen . Bei Säugetieren wird die Sexualität häufig durch sexuelle Dimorphismen aufrechterhalten, bei denen sich einige Komponenten so entwickelt haben, dass sie sexuelle Merkmale aufweisen, die speziell im Gehirn verarbeitet werden12,13,90, während andere die Folgen einer geschlechtsspezifischen Stoffwechselverarbeitung36 und der Immunabwehr sind91,92. Nicht alle geschlechtsspezifischen Proteine ​​und Verbindungen sind an der chemischen Signalübertragung beteiligt. Aus unseren Daten und anderen Studien können wir jedoch erkennen, dass es wahrscheinlich ist, dass für die chemischen Signale von Mäusen ein kleiner Effekt vieler Moleküle und nicht ein starker Effekt einiger weniger charakteristisch ist, ähnlich wie bei den perioralen Sekreten von Maulwurfsratten93. In unseren Daten wird Sexualität gut durch Lipocaline (z. B. MUPs, OBPs, LCNs) dargestellt, die für ihre Rolle in der chemischen Kommunikation bekannt sind, sowie durch mehrere flüchtige Stoffe, die in vielen Labors (z. B. SBT, Farnesene, Pyrazine usw.) und Arten untersucht wurden , zum Beispiel die Maulwurfsratten93. Allerdings wurden die meisten Proteine ​​und flüchtigen Stoffe in unseren Daten bisher nicht im Zusammenhang mit der sexuellen Signalübertragung untersucht. Natürlich wäre es am besten, jede der erkannten Verbindungen in individuellen Verhaltenskonstellationen zu testen, aber das ist praktisch unmöglich. Eine weitere Option, die in diesem Artikel vorgestellt wird, ist eine Vorauswahl auf der Grundlage der Suche nach Verbindungen, die korrelierte Muster aufweisen und daher das Potenzial haben, biologische Merkmale wie Geschlecht, Unterart und Hygienestatus eines Individuums darzustellen. Wenn ein flüchtiger Stoff zu hydrophob ist, benötigt er einen Proteintransporter, der dem Liganden helfen kann, in die wässrige Umgebung (z. B. Urin) einzudringen. Daher kann man davon ausgehen, dass Proteine ​​und flüchtige Stoffe bis zu einem gewissen Grad korrelieren, und genau das zeigt unsere Studie. Flüchtige Stoffe korrelieren mit Proteinen, aber nur wenige sind in größeren Netzwerken von Proteinen und ihren potenziellen Liganden organisiert. Wenn diese Korrelationen extrahiert werden, können wir mutmaßliche Beziehungen zwischen Kombinationen von Proteinen und Liganden wie MUP20 und 2-Acetyl-3-Thiazolin sowie den neuen mutmaßlichen Paaren (z. B. LCN11 und 2(5H)-Furanon) erkennen. Wir sind uns bewusst, dass Korrelation nicht dasselbe ist wie Kausalität, aber dieser Ansatz könnte zu einer Reihe neuer Hypothesen führen, die auf der Komplexität der molekularen Profile basieren, die in dieser Studie aufgezeigt werden.

Abschließend haben wir mithilfe von Deep Learning und Datenintegration im Urinmetabolom und -proteom von Mäusen Moleküle identifiziert, die geschlechts- und unterartspezifisch sind und wahrscheinlich an der chemischen Signalübertragung beteiligt sind. Wir haben auch zum ersten Mal gezeigt, dass Sexualität durch mindestens 26 verschiedene Lipocaline und Calycine (12–16 sind weiblich) und nicht nur durch männlich orientierte MUPs zum Ausdruck kommt. Die Anzahl der gemeinsamen Peptide in dieser Gruppe von Proteinen macht jedoch die Notwendigkeit einer absoluten Quantifizierung dieser Proteine ​​auf der Grundlage unvoreingenommener Methoden deutlich. Darüber hinaus zeigten auffällige Unterschiede in der Häufigkeit geschlechtsspezifischer Moleküle zwischen DOM- und MUS-Mäusen, dass es während der Artbildung von DOM- und MUS-Mäusen zu einer starken Selektion der Systeme sexueller Signalisierung kam.

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit dem Gesetz der Tschechischen Republik § 17 Nr. durchgeführt. 246/1992. Der Umgang mit wildem MUS wurde von der örtlichen Ethikkommission der Fakultät für Naturwissenschaften der Karlsuniversität gemäß der Akkreditierungsnummer genehmigt. 27335/2013-17214. Wildmäuse wurden in der Zuchtanlage des Instituts für Wirbeltierbiologie in Studenec (genehmigt durch das Landwirtschaftsministerium 61974/2017-MZE-17214) gehalten. Die folgenden Stämme repräsentierten MUS (Armenien: MAM, Tschechien: MCZ und PWK, Georgien: MGA, Polen: MPB, Bulgarien: SOK und SVEN) und DOM (Algerien: BZO, Österreich: BING und URG, Zypern: DCA und DCP, Dänemark). : DDO, Italien: DJO, Portugal: SAGR und SOAL) (Einzelheiten siehe94,95,96 und https://housemice.cz/en/strains/). Diese Studie wurde gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) durchgeführt und berichtet.

In diesem Experiment (Abb. 5A) verwendeten wir insgesamt 56 Mäuse aus den drei Gruppen: wilde Mus musculus musculus (wMUS: direkte Nachkommen von wild gefangenen Mäusen, 10 Paare), Labor-M. m. Musculus (MUS: Generationen G3–G60 von im Labor gezüchteten Mäusen, 8 Paare) und Labor-M. m. Domesticus (DOM: Generationen G1-G67 von im Labor gezüchteten Mäusen, 10 Paare). Alle Individuen erhielten die gleiche Ernährung (ST1-Pellets, Velaz, Prag, Tschechische Republik) und Wasser nach Belieben und wurden unter stabilen Bedingungen gehalten (dh 14:10 h, D:N, Temperatur t = 23 °C). Wir haben ihren Urin vier bis sechs Mal gesammelt, um mögliche Verdünnungsunterschiede auszugleichen. Das endgültige Urinvolumen lag zwischen 25 und 100 μl pro Maus und alle Proben wurden vor weiteren Analysen eingefroren (–80 °C). Diese Proben wurden mit GCxGC-MS/MS vermessen und parallel dazu weitere 10 μl Proben für die nLC-MS/MS-Analysen von Proteinen verwendet (siehe unten). Keines der Tiere wurde während der Probenahme eingeschläfert oder getötet. Wir manipulierten Personen nur so, dass sie in ein Sammelröhrchen urinierten und dann in ihren Käfig zurückgebracht wurden.

Experimentdesign, Filterung und Normalisierung. Wir verwendeten Mäuseurin, der wiederholt von Individuen jeden Geschlechts aus den drei Gruppen – im Labor gezüchteten DOM und MUS und wildem wMUS (A) – entnommen wurde. Wir konzentrierten uns auf die Analyse ihrer Urinproteine ​​und flüchtigen Bestandteile. Wir haben flüchtige Stoffe ausgeschlossen, die nur in Blindproben auftraten (B, graue Balken), während diejenigen, die in Blindproben und Proben auftraten (grün), auf der Grundlage der hinteren p-Werte des Mixed-Normal-Modells ausgewählt wurden (siehe Methoden). Diejenigen, die einen p < 0,05 (dh entsprechende FD < 7,1) aufwiesen und zu Blindproben und Proben gehörten, wurden entfernt (rote Linie); dies entspricht der Identitätswahrscheinlichkeit IL < 0,9 (C). Die verbleibenden Verbindungen (N = 875) wurden als relevant angesehen, da sie nur in Proben oder in deutlich höheren Mengen in Proben als in Blindproben auftraten (FD > 7,1). Die Quantilnormalisierung ergab eine relativ geringe Variation der Signalintensitäten (SI) zwischen Proben (D). FD steht für Fold Difference. Röhren, Mausbilder und chemische Strukturen (A) wurden von den Autoren mit BioRender.com erstellt.

Flüchtige Urinbestandteile wurden mittels Headspace Solid Phase Micro Extraction (HS SPME) auf Fasern (DVB/CAR/PDMS_grey; Supelco, USA) entnommen. Die Proben wurden vor der Extraktion 5 Minuten lang bei 55 °C inkubiert. Die Extraktion wurde 10 Minuten lang durchgeführt. Die flüchtigen Bestandteile wurden mittels zweidimensionaler umfassender Gaschromatographie mit Massendetektion (GCxGC-MS; Pegasus 4D, Leco Corporation, USA) analysiert. Für die Trennung wurde eine Kombination aus mittelpolaren und unpolaren Trennsäulen verwendet: Primärsäule: SLB-IL60 (30 m × 0,25 mm, SigmaAldrich, USA); Sekundärsäule Rxi-5sil MS (1,4 m × 0,25 mm, Restek, Australien). Weitere Parameter wurden wie folgt eingestellt: Einlasstemperatur 270 °C, Spitless-Modus, konstanter He-Fluss 1 ml/min, Modulationszeit 4 s (Heißimpuls 0,6 s), Modulationstemperatur-Offset in Bezug auf den Sekundärofen 15 °C. Das auf den Hauptofen angewendete Temperaturprogramm: 50 °C (1 Minute halten), dann erhöhen (10 °C/Minute) auf 320 °C (3 Minuten halten). Der auf die Sekundärsäule angewendete Temperaturversatz betrug + 5 °C. Die Transferline-Temperatur wurde auf 250 °C gehalten. Der Massendetektor war mit einer EI-Ionenquelle und einem TOF-Analysator ausgestattet, die eine einheitliche Massenauflösung ermöglichten. Der gescannte Massenbereich betrug 30–500 m/z. Die Ionenquellenkammer wurde auf 250 °C gehalten. Zur Steuerung des Instruments und zur Datenverarbeitung wurde ChromaTOF v4.5 von LECO eingesetzt. Ausgewählte Verbindungen wurden durch Abgleich ihrer Massenspektren mit einer Massenspektrenbibliothek (NIST MS 2.2, USA) identifiziert.

Wir haben Histogramme der Datenverteilung erstellt und alle Zeilen mit Verbindungen entfernt, die nur in Blindproben und nicht in Proben vorkamen. Die resultierende Verteilung ist bimodal mit Verbindungen, die nur in Proben sowie in Proben und Blindproben auftraten, Abb. 5B. Um zu entscheiden, welche Verbindungen biologisch relevant sind, haben wir die Routine „mixtools“97 verwendet, die die A-Posteriori-Wahrscheinlichkeit für die Identität mit einem der beiden Peaks innerhalb der Mischung zweier überlappender Normalverteilungen berechnet. Wir haben alle Verbindungen ausgeschlossen, die mit Blindproben und Proben mit p <0,05 identisch waren (Abb. 5C). Um die Wahrscheinlichkeit der Identität mit einem der beiden Peaks zu veranschaulichen, verwendeten wir einen einfachen Identitätsindex LI = (Probe – Leerwert)/(Probe + Leerwert) im Bereich von −1 bis 1, sodass alle verbleibenden „biologisch relevanten“ Verbindungen LI > hatten 0,9 (Abb. 5C). Als nächstes verwendeten wir eine auf Quantilen basierende Normalisierung, die eine Matrix von Peakflächen (dh Intensitäten) mit der Funktion normalize.quantiles des Pakets „preprocessCore“ in der R-Software98 normalisiert, dargestellt in Abb. 5D. Um p-Werte unterschiedlich häufig vorkommender Verbindungen zu extrahieren, verwendeten wir das Power Law Global Error Model – PLGEM99, ähnlich wie bei der Analyse von Proteomen (siehe unten).

Alle Proteinproben wurden mit kaltem Aceton ausgefällt und 10 Minuten lang bei 14.000 rcf und 0 ° C zentrifugiert. Anschließend erfolgte eine Resuspension der getrockneten Pellets im Verdauungspuffer (1 % SDC, 100 mM TEAB – pH = 8,5). Die Proteinkonzentration jedes Lysats wurde mit dem BCA-Assay-Kit (Fisher Scientific) bestimmt. Cysteine ​​in 20 μg Proteinen wurden mit einer Endkonzentration von 5 mM TCEP (60 °C für 60 Minuten) reduziert und mit 10 mM MMTS (dh S-Methylmethanthiosulfonat, 10 Minuten bei Raumtemperatur) blockiert. Die Proben wurden mit Trypsin (1 ug Trypsin pro Probe) über Nacht bei 37 °C gespalten. Die Peptide wurden auf einer Michrom C18-Säule entsalzt. Es wurden Nano-Umkehrphasensäulen verwendet (EASY-Spray-Säule, 50 cm × 75 µm ID, PepMap C18, 2 µm Partikel, 100 Å Porengröße). Eluierende Peptidkationen wurden durch Elektrospray-Ionisation in Gasphasenionen umgewandelt und auf einem Thermo Orbitrap Fusion (Q-OT-qIT, Thermo) mit den gleichen Parametern wie in78,79,83 beschrieben analysiert.

LC-MS-Daten wurden mit der MaxQuant-Software (Version 1.6.34)66 vorverarbeitet. Die Falscherkennungsrate (FDR) wurde sowohl für Proteine ​​als auch für Peptide auf 1 % festgelegt und wir haben eine Mindestpeptidlänge von sieben Aminosäuren angegeben. Die Andromeda-Suchmaschine wurde für die MS/MS-Spektrenkartierung anhand unserer modifizierten Uniprot Mus musculus-Datenbank (heruntergeladen im Juni 2015) mit 44.900 Einträgen verwendet. Wir haben unsere Datenbanken so geändert, dass alle MUP- und OBP-Sequenzen entfernt wurden und stattdessen eine vollständige Liste der MUPs aus der Ensembl-Datenbank und der OBPs aus NCBI hinzugefügt haben (sensu-citation86). Als nächstes haben wir einige Tremble-Sequenzen hinzugefügt, die in Uniprot fehlten, zum Beispiel KLKs, BPIs, SPINKs, SCGB/ABPs und LCNs. Wir stellen diesen Datensatz im FASTA-Format als Ergänzungsdatensatz 1 zur Verfügung. Die Enzymspezifität wurde als C-terminal zu Arg und Lys festgelegt, was auch eine Spaltung an Prolinbindungen100 und maximal zwei fehlende Spaltungen ermöglicht. Als feste Modifikation wurde die Dithiomethylierung von Cystein und als variable Modifikationen die N-terminale Proteinacetylierung und Methioninoxidation ausgewählt. Die Funktion „Übereinstimmung zwischen Läufen“ von MaxQuant wurde verwendet, um Identifizierungen auf der Grundlage ihrer Massen und Retentionszeit (maximale Abweichung 0,7 Minuten) auf andere LC-MS/MS-Läufe zu übertragen. Quantifizierungen wurden unter Verwendung der markierungsfreien Algorithmen66 mit einer Kombination aus einzigartigen und Razor-Peptiden durchgeführt. Alle nachfolgenden Analysen wurden in der R-Software98 durchgeführt. Um zu überprüfen, ob die Datenverteilung nach der Normalisierung dem gleichen Verteilungstyp entspricht, haben wir „mixtools“97 verwendet. Zweitens haben wir das Power Law Global Error Model – PLGEM99 verwendet, um unterschiedlich exprimierte/häufig vorkommende Proteine ​​mithilfe der Funktionen plgem.fit und plgem-stn97 zu erkennen. Um die Bedeutung signifikanter Proteine ​​bei der Trennung zwischen Männern und Frauen zu ermitteln, verwendeten wir Random Forest zur Klassifizierung101 in der R-Software98. Alle Diagramme und Abbildungen wurden in R mit ggplot2102 generiert. R-Software wird unter den Bedingungen der GNU General Public License vertrieben. Kopien der beiden Versionen 2 und 3 der Lizenz finden Sie unter https://www.R-project.org/Licenses/. Original- und LC-MS/MS- und GCxGC/MS-Tabellen sind im Ergänzungsdatensatz 2 enthalten.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD037086 und https://doi.org/10.6019/PXD037086 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Ergebnistabellen stehen als ergänzende Daten zur Verfügung. Metabolomics-Daten wurden in der EMBL-EBI MetaboLights-Datenbank (https://doi.org/10.1093/nar/gkz1019, PMID: 31691833) mit der Kennung MTBLS7422 hinterlegt. Der vollständige Datensatz kann hier abgerufen werden: https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS7422.

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PS wurde durch das MICOBION-Projekt unterstützt, das von der EU H2020 finanziert wurde (Nr. 810224). TM wurde von der Grant Agency der Karls-Universität Prag (GAUK; Nr. 1191419) finanziert. Die Unterbringung von Mäusen in Studenec wurde vom CAS im Rahmen des Programms der Strategie AV 21 und vom CSF-Stipendium 16-23773S unterstützt. Das Projekt nutzte die Proteomic Core Facility, BIOCEV, Fakultät für Naturwissenschaften, Karls-Universität, Prag (unterstützt von OP VaVpI CZ.1.05/1.1.00/02.0109) für die massenspektrometrischen Messungen. Das Tschechische Zentrum für Phänomenologie wird von der Tschechischen Akademie der Wissenschaften RVO 68378050 und vom Projekt LM2018126 unterstützt. Tschechisches Zentrum für Phänomenologie, bereitgestellt von MEYS und CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 Modernisierung des Tschechischen Zentrums für Phänomenologie: Entwicklung in Richtung Übersetzungsforschung von MEYS und ESIF. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts. Wir sind Herrn Prof. sehr dankbar. Miloš Macholán für seine Kommentare zum ersten Entwurf dieses Manuskripts.

Abteilung für Zoologie, Fakultät für Naturwissenschaften, BIOCEV, Karls-Universität, Vestec, Prag, Tschechische Republik

Romana Stopková, Tereza Matějková, Alica Dodoková, Pavel Talacko, Petr Zacek & Pavel Stopka

Tschechisches Zentrum für Phenogenomik, Institut für Molekulargenetik der Tschechischen Akademie der Wissenschaften, Vestec, Tschechische Republik

Radislav Sedlacek

Forschungseinrichtung Studenec, Institut für Wirbeltierbiologie, Tschechische Akademie der Wissenschaften, Brünn, Tschechische Republik

Jaroslav Piálek

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RS, PS und AD schrieben den ersten Entwurf des Manuskripts, JP bereitete die Mausmodelle MUS und DOM in der Einrichtung Studenec vor und TM sammelte die Proben von wMUS. R.Se. half bei der experimentellen Gestaltung und beim Verfassen von Manuskripten. P.Ž. führte GCxGC-MS-Instrumente durch, PT führte nLC-MS/MS durch und beide halfen bei der Vorbereitung der endgültigen Datensätze. Alle Autoren haben am Schreiben mitgewirkt und das endgültige Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Pavel Stopka.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Stopková, R., Matějková, T., Dodoková, A. et al. Die Variation der chemischen Signale der Maus wird genetisch kontrolliert und durch die Umwelt moduliert. Sci Rep 13, 8573 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35450-8

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Eingegangen: 14. September 2022

Angenommen: 18. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35450-8

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